Thème : Interaction plantes/champignons

Poster n° 1

Biological control of Botrytis cinerea on Vitis vinifera L. plants by the use of fungal antagonist Ulocladium atrum

S. Ronseaux, E. Ait Barka, S. Compant and C. Clément
Université de Reims, UFR Sciences, URVVC UPRES EA 2069, P.O. Box 1039, Laboratoire de Stress, Défenses et Reproduction des Plantes, 51687 Reims Cedex 2, France

Botrytis cinerea is a necrotrophic pathogen that develops on many tissues of many cultivated plant species worldwide. Gray mould disease caused by Botrytis cinerea is probably the most common and widely distributed disease throughout the world. The control of this fungal diseases of grapevine is mainly by use of chemical fungicides, which have certainly decreased the incidence of fungal diseases, but at the same time have contributed to the appearance of fungicide-resistant strains of the pathogen. As a result, the legislation in most countries is becoming more severe. This has led to an increasing need for alternative techniques that do not leave any residues in the environment. One of the potential non-hazardous alternatives to the chemical fungicides is biological control, which consists of the use of biological processes to lower inoculum density of the pathogen in order to reduce crop loss.
The potential of two fungi (strains U16 and U13 of Ulocladium) to enhance the resistance of grapevine (Vitis vinifera L.) transplants toward gray mould has been investigated in order to select the best antagonist toward Botrytis cinerea.When B. cinerea was grown with the antagonists on the same PDA plate, a significant zone of inhibition was observed around the microorganisms inoculum. Furthermore, the strains U16 and U13 of Ulocladium reduced foliar stem infection by at least 30%, when applied simultaneously with the Botrytis cinerea. In the zone of interaction with the antagonist, microscopic observation revealed the presence of coagulation into the cytoplasm of Botrytis cinerea mycelium. In other cases, large vesicles appeared in cells of the mycelium, while others showed an empty mycelium devoid of cytoplasm.
Experiments with detached leaves from vitro-plants of Vitis vinifera L. showed its susceptibility to fungal attack, producing the common symptoms of gray mould during the first week following the inoculation with Botrytis cinerea. In contrast, under the same conditions vitroplants inoculated with antagonists were healthy, and exhibited only a small necrosis at the leaf surface in response to the pathogen attacks, thus confirming the result obtained in the bioassay.
An increase in chitinase activity in leaves was triggered by the presence of fungal antagonist. The ability of U. atrum to increase activity of chitinase, in addition to its known capacity to out-compete pathogen for nutrients and space, may be the basis of its biocontrol activity. Furthermore, grapevine plantlets co-cultured with Ulocladium atrum strain U13 grew faster and had significantly more secondary roots and leaf.
The experiments indicate that the utilization of antagonist induces the adaptation of young plantlets to overcome pathogen attacks, with a marked effect of the U13 strain.

Poster N° 2

Inactivation de la glutamine synthétase du champignon ectomycorhizien Hebeloma cylindrosporum par agrotransformation et ARN interférence

M. Bellion(1), A.G. Pardo(2), F. Martin(1), A. Brun(1), M. Chalot(1)
(1) UMR UHP - INRA 1136 Interactions arbres micro-organismes, Université Henri Poincaré, 54506 Vandœuvre-les-Nancy Cedex
(2) Programa de investigación en interacciones biológicas, Universidad Nacional de Quilmes, Roque Saenz Peña 180, B1876BXD Bernal, Provincia de Buenos Aires, Argentine

La transformation génique et plus spécialement la création de mutants délétés, qui sont des techniques largement utilisées chez Saccharomyces cerevisiae et même chez d'autres ascomycètes comme Neurospora, mais pour les basidiomycètes il n'y a pour le moment pas de possibilité de créer des mutants délétés pour un gène ciblé. La problématique est double : quelle méthode de transformation utiliser et que faut-il introduire dans la cellule pour obtenir des mutants, comme il n'y a pas de recombinaison homologue chez ces champignons ? Le but de notre travail est d'obtenir des souches fongiques mutantes pour lesquelles l'expression d'un gène est interrompue par le mécanisme d'ARN interférence. Ce phénomène a été observé chez beaucoup d'eucaryotes supérieurs et a pour conséquence la disparition totale du produit du gène concerné. En premier lieu nous sommes intéressés par le gène de la glutamine synthétase (GS) car son inactivité confère un phénotype clair (auxotrophie pour la glutamine). Le déclenchement du phénomène d'ARN interférence est basé sur la présence d'un ARN double-brin autocomplémentaire dans les cellules. Pour introduire cet ARN dans les cellules fongiques, nous avons recours à la transformation par Agrobacterium tumefaciens. Jusqu'ici il a été possible de construire une cassette qui contient un fragment du gène de la GS ainsi qu'une partie de ce fragment en sens inverse, qui lors de la transcription donnera un ARN qui pourra former une structure en tige-boucle, donc un ARN double-brin capable de déclencher l'ARN interférence. Cette cassette a été insérée entre un promoteur et un terminateur fongiques. Les plasmides binaires qui peuvent être utilisés pour l'agrotransformation de champignons sont rares et mal décrits, et l'optimisation de la phase d'insertion de la cassette dans le vecteur (pBIN+) est en cours.

Poster N° 3

Oryza sativa/Magnaporthe grisea : a model interaction for non-host resistance deciphering

A.C. Bily (1), M. Allègre (1), D. Tharreau (2), P. Schweizer (3), E. Guiderdoni (1), J.-B. Morel (2), P. Piffanelli (1)
(1) CIRAD UMR PIA, Avenue Agropolis - 34398 Montpellier Cedex 5
(2) UMR-BGPI, Avenue Agropolis - 34398 Montpellier Cedex 5
(3) Department of Cytogenetic. The Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK), D-06466 Gatersleben, Germany
Resistance exhibited by a plant species to the majority of potentially pathogenic microbes is known as non-host resistance. The events leading to non-host resistance in plants represent one of the least understood phenomena and a remaining challenge in the field of plant-microbe interaction.
Non-host resistance also represents one of the most promising defence mechanisms in developing durable resistance against plant pathogens, mainly due to its effectiveness against a broad range of pathogen species and its durability in nature compared to race-specific R gene-dependent resistance.
Rice-Magnaporthe grisea is a model patho-system for race-specific cereal disease resistance study. At the species level, Magnaporthe grisea infects more than 50 monocotyledons. However, at the strain level, this fungus exhibits a narrow host spectrum. We are currently developing a biological model using rice cultivars and several non-host M. grisea strains (pathogenic on wheat and maize) to elucidate mechanisms implicated in non-host interaction. Cytological analysis will help us to pinpoint where the fungus is blocked in the host tissues. Transcriptome (macroarray and northern-blot) analyses will enable us to identify non-host differentially expressed genes. A reverse genetic strategy is underway to target rice T-DNA insertion mutants (Genoplante) that could be potentially affected in non-host resistance.
It is expected that this model will shade some light into the genetic basis of non-host resistance defining the signalling and effectors components involved in these phenomena in rice and applicable to other cereal species.

Poster N° 4

Resistance of the wheat line Kavkaz-K4500 L.6.A.4 to septoria tritici blotch controlled by isolate-specific resistance genes

L. Chartrain(1,2), S.T. Berry(3) and J.K.M. Brown(1)
(1) Deptartment of Disease and Stress Biology, John Innes Centre, Norwich Research Park, Norwich NR4 7UH, UK.
(2) ENSAT, Laboratoire de Biologie et Amélioration des Plantes, Avenue de l'Agrobiopole, BP 107, 31326 Castanet-Tolosan, France.
(3) Advanta Seeds UK Ltd, Station Road, Docking, King's Lynn, Norfolk, PE31 8LS, UK

The CIMMYT breeding line Kavkaz-K4500 L.6.A.4.(KK) is one of the major sources of resistance to septoria tritici blotch (STB) of wheat. In the UK, KK is resistant to STB in field conditions even though a large majority of Mycosphaerella graminicola isolates are virulent to it. The genetics of the resistance of KK to four isolates of M. graminicola were investigated. KK has at least five isolate-specific resistance genes including Stb6 on chromosome 3A and a second gene for resistance to isolate IPO323, two genes on chromosome 4A, one of which may be Stb7 and a gene named Stb12, a gene named Stb10 on chromosome 1D. These results suggest that high levels of field resistance to STB may be achieved by 'pyramiding' several isolate-specific resistance genes.

Poster N° 5

Les Chitine synthases de Botrytis cinerea : Caractérisation d'une famille multigénique choisie pour cible antifongique

M. Choquer(1), M. Boccara (2), M.-C. Soulié(2), H. Becker(1), A. Thellend (1), A. Piffeteau(1) et A. Vidal-Cros(1)
(1) UMR7613 CNRS / Université Paris VI, Structure et Fonction de Molécules Bioactives, Boite 182, 75252 Paris cedex 05
(2) UMR217 INRA / Université Paris VI / INA P-G, Laboratoire de Pathologie végétale, 16 rue Claude Bernard, 75005 Paris

Dans le contexte de la lutte chimique contre les champignons pathogènes, nos équipes s'intéressent à une stratégie antifongique basée sur l'altération de la biosynthèse des microfibrilles de chitine (1). Ce polysaccharide de ?1,4-N-acétylglucosamine est un composant essentiel de la paroi fongique, structure continuellement modifiée et réarrangée au cours du cycle cellulaire. Les activités chitine synthases (CHS), responsables de sa polymérisation présentent l'avantage majeur d'être absentes chez les plantes et les mammifères. Cependant leur étude se révèle complexe car elles sont codées par une famille multigénique, constituée jusqu'à huit représentants chez les ascomycètes filamenteux et qui pourraient jouer des rôles très différents dans la morphogénèse et la viabilité du champignon. De premiers analogues de substrats de chitine synthases ont été synthétisés mais se sont révélés de mauvais inhibiteurs in vitro (2), et notre équipe s'oriente maintenant vers un test de screening à haut débit d'une banque aléatoire de molécules. Afin d'optimiser cette stratégie antifongique, nous avons choisi d'étudier les chitine synthases du champignon phytopathogène Botrytis cinerea. Nous nous sommes fixés comme objectifs de faire l'inventaire des gènes codant les activités CHS et de déterminer leur fonction dans la croissance et le pouvoir pathogène du champignon, afin de dégager l'importance relative de chaque isoenzyme (3). Au cours de cette communication seront présentées plus précisément la démarche adoptée pour accéder à la totalité des gènes Chs de B. cinerea et à leur séquence, et pour étudier leur expression (4). L'obtention et la caractérisation de premiers mutants CHS, présentées par Marie-Christine Soulié dans une autre communication (voir son résumé), nous ont permis d'initier une étude structure-fonction sur une chitine synthase importante pour la virulence de Botrytis cinerea.
(1)Vidal-Cros A and Boccara M (1998) Identification of four chitin synthases genes in the rice blast disease agent Magnaporthe grisea. FEMS Microbiology Letters 165, 103-109.
(2)Xie J, Thellend A, Becker H and Vidal-Cros A (2001) Synthesis and evaluation of a C-glycosyl nucleoside as an inhibitor of chitin synthase. Carbohydrate Research 334, 177-82.
(3)Soulié MC, Piffeteau A, Choquer M, Boccara M and Vidal-Cros A (2003) Disruption of Botrytis cinerea class I chitin synthase gene, BcchsI, results in cell wall weakening and reduced virulence. Fungal Genetics and Biology 40(1): 38-46.
(4)Choquer M, Boccara M and Vidal-Cros A (2003) A semi-quantitative RT-PCR method to readily compare expression levels within Botrytis cinerea multigenic families in vitro and in planta. Current Genetics 43(4): 303-309.

Poster N° 6

Chitosan activates resistance of Vitis vinifera L. against the gray mould agent Botrytis cinerea

S. Compant, E. Ait Barka, C. Clément
Université de Reims, UFR Sciences, URVVC UPRES EA 2069, P.O. Box 1039, Laboratoire des Stress, Défenses et Reproduction des Plantes, 51687 Reims Cedex 2

Gray mould disease caused by Botrytis cinerea is probably the most common and widely distributed disease of vegetables, ornamental plants, fruits, and even field crops throughout the world. Chemical control of Botrytis has been partially successful, due to the risk of appearance and establishment of resistance to Botrytis is considerable. Chitosan, a high molecular weight ß-1,4-glucosamine polymer, has been reported as antifungic against a wide range of plant pathogen including Botrytis cinerea. Nevertheless, no experiment has been realized on the potential activity of chitosan to enhance resistance of grapevine toward this pathogen.
The objective of this study was to determine whether chitosan treatment would undermine the negative effetc of Botrytis cinerea, and reduce the pesticide application.
When the pathogen was inoculated in petri dishes amended with 0.1 mg/mL of chitosan, the growth of the fungus was suppressed and the hyphae structure presented a growth disruption and a coagulation of cytoplasm. Thus, the mycelium apparead degraded, with large vesicles inside the cell cytoplasm. In many cases, the mycelium cells had either no cytoplasm or the cytoplasm was devoid of organelles. It seems that the chitosan inhibits the growth of Botrytis cinerea by disrupting cellular membranes and inducing cell death. Botrytis cinerea generates the characteristic gray mould symptoms on leaves within 72 hours following the inoculation. However, when the fungus was inoculated 24 h after foliar spray with chitosan (0.1 mg/mL), the symptoms of gray mould failed to develop, thus confirming the results obtained above. Microscopic analysis of leaves confirmed the protective effect of chitosan before inoculation with the pathogen. In order to understand the mechanism by which chitosan may protect grapevine against Botrytis cinerea, we analyzed two Pathogenesis-Related proteins involved in plant defense, chitinase and ß-1,3-glucanases. Chitosan enhanced the activities of both enzymes.
This explain in part how chitosan stimulates defense mechanism, pre-immunizing thus leaves before inoculation with the pathogen. This study demonstrates for the first time the beneficial effect of chitosan on gray mould control on grapevine.

Poster N° 7

Mise au point d'un marqueur de l'endomycorhization chez le lin Linum usitatissimum

C. Flamand, B. Randoux, B. Tisserant, A. Grandmougin-Ferjani et R. Durand
Université du Littoral-Côte d'Opale, Laboratoire de Mycologie-Phytopathologie-Environnement, 17 avenue Blériot, BP 699, 62228 Calais cedex

Les endomycorhizes constituent une association symbiotique extrêmement répandue. Cette symbiose concerne plus de 80 % des plantes vasculaires. Cette association à bénéfice réciproque confère aux plantes mycorhizées une meilleure nutrition minérale et hydrique, ainsi qu'une meilleure résistance face à des stress biotiques ou abiotiques. Il est donc particulièrement intéressant d'évaluer la mycorhization des plantes de grandes cultures. Actuellement, cette évaluation de la colonisation racinaire par les champignons mycorhiziens à arbuscules (MA) peut être réalisée par des techniques de coloration suivies d'observation microscopique. Néanmoins, ces techniques s'avèrent longues, fastidieuses et dépendantes de l'expérimentateur. Il était donc utile de développer de nouveaux marqueurs tant biochimiques que moléculaires permettant de quantifier l'endomycorhization des racines. Des méthodes basées sur des marqueurs lipidiques (acides gras, stérols) ont été développées par plusieurs auteurs (Olsson et al, 1997 ; Fontaine et al, 2003). Nous nous proposons de développer une méthode alternative et complémentaire, basée sur l'expression différentielle de gènes végétaux suite à la mycorhization. En effet, Walter et al (2000), ont mis en évidence dans leurs travaux sur le mais que la voie plastidiale de biosynthèse des isoprénoides est soumise à régulation par le champignon mycorhizien. Deux gènes codant des enzymes de ce métabolisme, la 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS) et la 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate réductoisomérase (DXR), présentent un taux de transcrits plus élevé quand les racines sont mycorhizées. Notre objectif est de disposer d'anticorps polyclonaux dirigés conte le produit du gène dxr. Ces anticorps seront utilisés comme outil afin de quantifier la mycorhization des racines d'une plante de grande culture, le lin Linum usitatissimum. La mycorhization de cette plante a été obtenue sur des cultures in vitro de racines transformées. Suite au clonage du gène dxr, nous vérifierons sur nos modèles (culture en pot et culture in vitro), la surexpression de ce gène dans les racines et sur la partie aérienne des plantes. L'introduction de ce gène dans un vecteur d'expression bactérien permettra d'obtenir une protéine recombinante en vue de la production d'anticorps.

Poster N° 8

Monitoring the gene expression in poplar roots interacting with ectomycorrhizal fungi

A. Kohler and F. Martin
UMR INRA-UHP 1136 Interactions Arbres/Micro-organismes, Centre INRA de Nancy, 54280 Champenoux

Ectomycorrhiza formation and function alter both fungal and plant gene expression. From the plant side, only little information is available about the consecutive gene expression patterns required for the recognition of the symbiotic partners, the morphological alteration of the root, and the modifications of the metabolism to ensure an accurate nutrient exchange between the symbiotic partners. Most of this information was obtained with the Eucalyptus globulus-Pisolithus tinctorius system (Voiblet et al. 2001).
Here, we used the model tree poplar and applied the cDNA array technology to answer the following questions: What transcriptional alterations lead to the formation of the ectomycorrhizal tissues? What genes are expressed in a functional ectomycorrhiza? And do the symbiosis-related genes differ in root tips interacting with varying fungal partners?
To address these questions we developed an in vitro-mycorrhization system consisting of the poplar hybrid INRA 717 -1B4 (P. tremula x P. alba) and one of the three fungal partners Pisolitus microcarpus, Paxillus involutus, or Laccaria bicolor.
From our large scale sequencing project we obtained 7000 poplar root ESTs (Kohler et al. 2003). A selection of these clones and a small number of fungal clones from Laccaria bicolor and Pisolithus microcarpus were used to design an appropriate cDNA array.
First results of this study will be presented and discussed.
Voiblet C, Duplessis S, Encelot N, Martin F. 2001. Identification of symbiosis-regulated genes in Eucalyptus globules- Pisolithus tinctorius ectomycorrhiza by differential hybridization of arrayed cDNAs. Plant J. 25: 181-191.
Kohler A, Delaruelle C, Martin D, Encelot N, Martin F. 2003. The poplar root transcriptome: analysis of 7000 expressed sequence tags. FEBS Lett. 542: 37-41

Poster N° 9

Interactions entre le champignon de Paris Agaricus bisporus et Verticillium fungicola, pathogène responsable de la môle sèche

M. Largeteau, C. Ayax, J.-M. Savoie
INRA Centre de Bordeaux Aquitaine, UR430, BP81, 33883 Villenave d'Ornon Cedex.

Le champignon de Paris Agaricus bisporus est cultivé partout dans le monde. La France est le quatrième producteur mondial et le deuxième en Europe après les Pays-Bas. Les producteurs disposent de souches à haut rendement et de bonne qualité mais se trouvent confrontés à d'importantes pertes en cultures dues aux maladies. Le pathogène le plus fréquent actuellement est Verticillium fungicola, agent responsable de la môle sèche. La maladie se traduit par la production de masses de tissus indifférenciés (les môles) ou de champignons à pied éclaté. Le stade de développement du champignon de Paris (tête d'épingle à primordium) auquel l'infection a lieu pour produire une môle n'était pas identifié, pas plus que la progression du pathogène dans les tissus de l'hôte. Nos travaux ont visé à répondre à ces questions et à initier une recherche de gènes impliqués dans le processus infectieux. La détection d'A. bisporus et de V. fungicola par PCR à l'aide de deux couples d'amorces, chacun spécifique d'une région ITS de l'un des organismes, a permis de détecter le pathogène au tout premier stade de développement de l'hôte appelé tête d'épingle (petite sphère d'environ 2 mm de diamètre). La proportion des deux organismes, hôte et pathogène, a été déterminée chez des môles et des champignons à pied éclaté dans des tissus blancs d'aspect sains et bruns d'aspect nécrosé. Verticillium fungicola est toujours présent dans les tissus blancs et varie de 15 à 25% pour les môles et de 28 à 50% pour les champignons à pied éclaté. Les tissus bruns sont formés par une proportion de V. fungicola généralement plus importante, atteignant 65% dans les champignons à pied éclaté et 68% dans les môles.
Les tyrosinases sont connues pour intervenir dans les phénomènes de brunisement d'A. bisporus lors de l'attaque par Pseudomonas tolaasii. Une activité tyrosinase a été détectée dans le sporophore sain mais ni dans la môle ni dans le mycélium végétatif. D'autre part, une activité laccase a été détectée dans le mycélium végétatif et dans la môle mais pas dans le sporophore sain. Ces données nous ont amené à rechercher l'effet de V. fungicola sur l'expression des gènes de ces polyphénol oxydases. L'expression du gène ppo1 (tyrosinases constitutives) est identique en présence ou non du pathogène, quel que soit le stade de développement d'A. bisporus. Par contre l'expression du gène ppo2 (tyrosinases inductibles) diminue fortement entre les stades primordium et sporophore issus de culture saine et ne varie pas, en culture contaminée, entre le stade primordium et la môle. Ceci laisse supposer qu'elles sont responsables, du moins en partie, du brunissement des tissus observé dans les môles et les champignons à pied éclaté. Les gènes lcc1 et lcc2 des laccases sont exprimés faiblement et uniquement jusqu'au stade primordium dans les cultures saines tandis qu'ils sont exprimées de façon plus intense du stade tête d'épingle à la môle dans les cultures contaminées par V. fungicola. Cette expression des laccases dans la môle indique que le programme de développement d'A. bisporus en sporophore est stoppé rapidement après infection ce qui conduit à la môle formée d'un mélange des deux mycéliums.

Poster N° 10

Etude du déterminisme génétique de diverses sources de résistance de la vigne au mildiou

S. Merdinoglu(1), P. Coste(1), V. Dumas(1), A. Bouquet(2), L. Bordenave(3), S. Decrocq(3) et D. Merdinoglu
(1) INRA Laboratoire de Génétique et d 'Amélioration des Plantes 28 rue de Herrlisheim, 68021 Colmar cedex
(2) INRA-ENSAM 34060 Montpellier cedex 1
(3) INRA Bordeaux 33883 Villenave d'Ornon cedex

Le mildiou de la vigne est causé par Plasmopara viticola. Tous les cépages actuellement plantés dans le monde sont tous issus de l'espèce Vitis vinifera qui est sensible au mildiou. Cette maladie est endémique et se développe rapidement en une épidémie occasionnant l'application préventive et répétée de fongicides (10 à 12 traitements en zone septentionnale). L'utilisation de dérivés cupriques comme la bouillie bordelaise depuis plus d'une centaine d'années a pour conséquence une accumulation importante de cuivre dans les sols. Cet élément n'étant pas biodégradé, il présente une activité toxique sur les organismes non-cibles des sols viticoles. L'utilisation de fongicides pénétrants ou systémiques a conduit à faire émerger des souches de mildiou résistantes à certaines de ces molécules. Dans un contexte de lutte intégrée, l'utilisation de cépages de vigne résistants au mildiou peut être un élément majeur dans la diminution du nombre de traitements. Pour implanter une résistance durable, la création de ce type de matériel végétal nécessite d'analyser diverses sources de résistance, d'identifier et de cartographier le nombre de gènes qui les gouverne afin de cumuler dans un même génotype des gènes de résistance complémentaires.
Dans un premier temps, nous avons développé un bioessai fiable et rapide permettant d'évaluer quantitativement le niveau de résistance de populations de plantes issues de croisement, ségrégantes pour le caractère de résistance. Ce bioessai consiste à inoculer artificiellement des disques foliaires et à évaluer la résistance par la mesure de la densité de sporanges émis par unité de surface foliaire, à l'aide d'un compteur de cellules.
Différentes sources de résistance appartenant au genre Vitis ont été testées. Deux espèces de Vitis présentant une résistance partielle de haut niveau et une espèce du genre Muscadinia dont la résistance est totale ont été croisées avec Vitis vinifera. Les résultats du phénotypage des trois populations issues de ces croisements seront présenté.

Poster N° 11

Hérédité de la résistance à l'oïdium et au mildiou dans une lignée de melon

L. Perchepied(1), M. Bardin(2) et M. Pitrat(1)
(1) INRA/Unité de génétique et d'amélioration des fruits et légumes, Domaine St Maurice, BP94, 84143 Montfavet Cedex
(2) INRA/Unité de pathologie végétale, Domaine St Maurice, BP94, 84143 Montfavet Cedex

Différents agents pathogènes peuvent attaquer les cultures de melon et compromettre la récolte de produits de qualité. Le mildiou causé par Pseudoperonospora cubensis a été décrit dans le milieu des années 80 sur melon en France. Il provoque des symptômes de nécrose du feuillage. L'oïdium causé principalement par Sphaerotheca fuliginea (Podosphaera xanthi) attaque les plantes en occasionnant un feutrage blanc à la surface des feuilles pouvant entraîner une nécrose prématurée des feuilles contaminées. Des résistances de bon niveau ont été mises en évidence dans différentes lignées d'origine indienne, mais il n'existe pas encore de variétés de type Charentais possédant une résistance même partielle au mildiou. En effet des études génétiques ont montré que la résistance au mildiou est sous contrôle polygénique. En ce qui concerne l'oïdium, des variétés résistantes sont régulièrement commercialisées mais se révèlent parfois sensibles au champ. La résistance est majoritairement sous contrôle génétique simple et différentes races physiologiques ont été mises en évidence pouvant expliquer la perte d'efficacité de certaines résistances. Ces races ont été établies sur une gamme d'hôte différentielle de melon possédant différents gènes de résistance. La lignée d'origine indienne PI124112 possède la particularité d'être à la fois résistante au mildiou et à l'oïdium. Dans cette étude, l'hérédité de la résistance à ces deux maladies est évaluée.
Une population de 120 lignées recombinantes a été développée pour étudier ces résistances : Védrantais x PI 124112 (Ved124). Ces lignées recombinantes ont été évaluées phénotypiquement pour leur comportement vis-à-vis du mildiou et pour la résistance à 4 races de S. fuliginea : races 1, 2, 3 et 5. Nous avons réalisé en parallèle une carte génétique de moyenne densité sur la population Ved124 et couvrant l'ensemble du génome en choisissant des marqueurs sur la carte de référence du melon (AFLP, SSR et ISSR).
Trois gènes expliquent la résistance aux 4 races d'oïdium : un gène A contrôle la résistance aux races 1 et 2, un gène B confère la résistance aux races 1, 2 et 3, et un gène C contrôle la résistance aux races 1, 2 et 5. Les gènes B et C ont été cartographiés sur la carte génétique Ved124, le gène B sur le groupe de liaison V et le gène C sur le groupe de liaison XII.
La carte génétique Ved124 nous a également permis de détecter 6 QTL de résistance au mildiou sur six groupes de liaison. Un QTL majeur explique 30% de la variation phénotypique. Ce QTL est détecté sur le gène de résistance aux races 1, 2 et 5 de S. fuliginea sur le groupe de liaison XII.
Le QTL majeur de résistance au mildiou colocalise donc avec un gène de résistance aux races 1, 2 et 5. Des études plus précises de ce cluster de gènes de résistance à l'oïdium et du QTL de résistance au mildiou sont en cours.
Ces travaux ont été réalisés dans le cadre d'un contrat CIFRE avec les sociétés ASL, CLAUSE TEZIER, GAUTIER, RIJK ZWAAN, SEMINIS et TAKII.

Poster N° 12

Expression de gènes PR-10 chez le pommier : induction par des éliciteurs chimiques et en situation incompatible avec Venturia inaequalis - Recherche de l'activité biologique

C. Campion(1), C. Roux(1), P. Poupard(1), L. Parisi(2), M. Chevalier(3), P. Simoneau(1)
UMR Pathologie Végétale,
(1) UFR Sciences, Université d'Angers, 2 boulevard Lavoisier, 49045 Angers Cedex 01,
(2) Unité de Pathologie Végétale, INRA Centre d'Angers, 42 rue G. Morel, BP 57, 49071 Beaucouzé Cedex.
(3) Unité d'Amélioration des Espèces Fruitières et Ornementales, INRA Centre d'Angers, 42 rue G. Morel, BP 57, 49071 Beaucouzé Cedex

Deux sous-classes de gènes (nommés APa et APb) codant des protéines PR-10 et s'exprimant dans les feuilles de pommier (cv. Golden delicious) ont été mises en évidence (1). La sous-classe APa renferme au moins deux membres : AP1 (Ypr10*Md.b) et AP4 (Ypr10*Md.d). L'expression de ces deux gènes a été étudiée après l'application d'un analogue ou d'un générateur d'hormones végétales (acide salicylique, éthylène) ou en fonction de l'interaction compatible/incompatible avec Venturia inaequalis, l'agent de la tavelure (2). L'expression de ces deux gènes est activée, d'une part après le traitement par le générateur d'éthylène, d'autre part au moment de l'apparition des premiers symptômes de résistance en situation incompatible avec V. inaequalis. L'analogue d'acide salicylique (AS) est à l'origine de l'induction de l'expression d'AP4 mais pas d'AP1. Ces résultats sont en accord avec des sites potentiels de fixation de facteurs de transcription (élément TCA, élément ERE, boîte W) observés dans les régions promotrices d'AP1 et AP4. Nos résultats suggèrent que les deux voies de signalisation principales connues chez les plantes (dépendante/indépendante de l'AS) seraient impliquées dans l'induction de l'expression des gènes PR-10. D'autres situations d'interaction (dont l'interaction pommier-Venturia pyrina, agent de la tavelure du poirier) sont en cours d'étude de façon à déterminer si l'activation d'AP1 et AP4 observée en situation incompatible avec V. inaequalis est spécifique. La question de la relation entre l'activation de l'expression de ces gènes et les mécanismes de résistance du pommier à V. inaequalis reste à élucider, et ceci, d'autant plus que les propriétés biologiques des PR-10 sont encore mal connues. Sachant qu'elles pourraient présenter une activité RNase (3), ce type d'activité a été recherché chez les protéines AP1 (sous-classe APa) et AP3 (sous-classe APb) obtenues sous forme recombinante, mais aucune activité RNase n'a pu être mise en évidence. L'étude de l'activité biologique d'AP1 et AP3 se poursuit par une exploration des possibilités de liaison avec différentes molécules d'origine végétale. En effet, les PR-10 présentent des sites de liaison potentiels avec plusieurs types de molécules et des isoformes PR-10 (Bet v 1 chez le bouleau, et Pru av 1, chez la cerise) sont capables de se lier notamment avec des cytokinines et des phytostéroïdes. Cette propriété serait importante pour la fonction biologique des PR-10, qui pourraient avoir un rôle de transporteur chez les plantes (4).
(1) Ziadi et al. (2001) Physiol. Mol. Plant Pathol. 59 : 33-43.
(2) Poupard et al. (2003) Physiol. Mol. Plant Pathol. 62 : 3-12.
(3) Swoboda et al. (1996) Physiol. Plant. 96 : 123-133.
(4) Markovic-Housley et al. (2003) J. Mol. Biol. 325 : 433-438.

Poster N° 13

Mise au point d'un système rapporteur fluorescent chez le champignon symbiotique Hebeloma cylindrosporum

D. Rekangalt(1), M. C. Verner(1), P.J. Walser(2), U. Kües(2, 3), R. Marmeisse(1), J.C. Debaud(1), L. Fraissinet-Tachet(1)
(1) Université Lyon 1, UMR CNRS 5557 d'Ecologie Microbienne, Bât Lwoff, 43 Bd. Du 11 Novembre, 69622 Villeurbanne Cedex
(2) Institute of Microbiology, ETH Zürich, Schmelzbergstrasse 7, CH-8092 Zürich, Suisse
(3) Georg-August-University Goettingen, Institute for Forest Botany, Molecular Wood Biotechnology, Buesgenweg 2, D-37077, Goettingen, Allemagne

La symbiose ectomycorhizienne améliore la nutrition hydro-minérale des plantes hôtes; elle protège aussi les plantes contre les pathogènes racinaires ou encore contre l'effet toxique des métaux lourds. Les ectomycorhizes sont des structures hautement organisées dont la mise en place implique vraisemblablement des processus morphogénétiques spécifiques résultant d'une réorientation de l'expression des génomes aussi bien fongiques que végétaux. L'interaction modèle étudiée est Hebeloma cylindrosporum (Basidiomycète, Agaricale) x Pin maritime. L'utilisation d'un système d'expression hétérologue utilisant la protéine fluorescente verte ("Green Fluorescent Protein " ou GFP) chez Hebeloma cylindrosporum serait une manière élégante d'analyser l'expression spatio-temporelle de gènes d'intérêt nécessaires à l'établissement ou au bon fonctionnement de la mycorhize. Un tel système permettrait d'étudier la localisation de protéines-fusion au sein de la cellule fongique et/ou l'expression de gènes non seulement dans les divers "compartiments " fongiques (hyphes intra- et/ou extra-racinaires de la mycorhize, carpophores etc…) mais aussi en fonction du temps et de différentes conditions environnementales.
La transformation d'Hebeloma cylindrosporum a été effectuée avec une construction plasmidique contenant le gène de la sgfp entouré de deux introns et situé en amont du promoteur cgl1 de Coprinus cinereus. Le gène cgl1 code une galectine exprimée dans les primordia et les fructifications matures de Coprinus cinereus. Des analyses par microscopie à épifluorescence et des dosages au spectrofluorimètre ont montré que le gène codant la SGFP, bordé de deux d'introns, s'exprime efficacement et permet la production d'une protéine fluorescente verte fonctionnelle. Parmi les 55 transformants, seuls deux émettent une fluorescence élevée. Leur fluorescence est localisée dans le cytoplasme (absente des vacuoles) indiquant ainsi le lieu de synthèse de la GFP. L'absence de corrélation entre l'intensité de la fluorescence et le nombre d'intégrations plasmidiques indique que i) le promoteur cgl1 de C. cinereus s'exprime mal chez H. cylindrosporum dans nos conditions ; ii) la forte fluorescence observée dans les transformants B17 et F67, non corrélée avec le nombre de copies plasmidiques, est probablement due à l'intégration de leur vecteur d'expression dans le génome d'H. cylindrosporum en amont de séquences promotrices activatrices.

Poster N° 14

La défense et la modification de la paroi, deux fonctions extracellulaires associées à la résistance tardive du tabac aux Oomycètes

M.-P. Rivière(1), K. Hugot(1)(4), C. Moreilhon(2), M.A.Dayem(2), J. Cozzitorto(3), G. Arbiol(1), P. Barbry(2), C. Weiss(3), E. Galiana(1)
(1) INRA, Unité Interactions Plantes-Microorganismes, Antibes, France
(2) CNRS, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire, Sophia-Antipolis, France
(3) BASF Plant Science, Triangle Research Park, North Carolina, USA
(4) UMR ROSE, Génomique fonctionnelle des insectes, Valbonne, France

Le développement, chez la plante, peut être associé à l'acquisition de différentes formes de résistance, mises en place en réponse à des stimuli endogènes et indépendamment de toute interaction pathogène préalable. Par exemple, chez le tabac, la transition de l'état végétatif à l'état floral s'accompagne d'une transition de la sensibilité vers la résistance vis-à-vis de Phytophthora parasitica. Cette résistance affecte la capacité de l'oomycète à infecter et à coloniser les tissus végétaux et est associée à l'accumulation d'une activité cytotoxique extracellulaire qui provoque, in vitro, la mort cellulaire des zoospores de Phytophthora. Afin de déterminer les évènements extracellulaires impliqués dans l'inhibition de la croissance de l'agent pathogène, nous avons sélectionné des gènes codant des protéines membranaires ou sécrétées, exprimés dans les feuilles de plantes à l'état floral. L'utilisation d'un système de complémentation génétique fonctionnelle chez la levure (la technique SST pour Signal Sequence Trap) nous a permis de sélectionner 350 clones correspondant à des protéines apoplastiques, pariétales ou membranaires. Ces protéines sont impliquées dans les réponses au stress, dans les réactions de défense de la plante ou dans les modifications de la paroi cellulaire. Des analyses effectuées à l'aide de microarrays et de northern blot sur les gènes correspondant à ces protéines ont révélé une régulation coordonnée, lors des phases tardives du développement végétal, de gènes impliqués dans la SAR ou dans la liaison des protéines de structure à la paroi cellulaire,. Ces résultats suggèrent que ces fonctions extracellulaires participent à l'expression de la résistance. L'analyse de l'influence de l'acide salicylique sur l'accumulation des ARNm indique également un réseau de régulation de l'expression des gènes, aux stades tardifs du développement du tabac, plus complexe que celui impliqué dans la SAR. Une caractérisation complémentaire de ces gènes va permettre de formuler des hypothèses afin d'expliquer la résistance et d'établir des connections avec le développement.

Poster N° 15

Mise en évidence d'une phospholipase de type D dans la régulation de la production d'une protéase acide chez Botrytis cinerea

S. Rolland, M. Fèvre et C. Bruel
Laboratoire de Biologie Cellulaire Fongique. U.M.R. 5122. 10 Rue Dubois, Université Claude Bernard Lyon 1, 69622 Villeurbanne

Lors du processus infectieux, le champignon phytopathogène B.cinerea sécrète de nombreuses enzymes lytiques qui permettent de coloniser les tissus de l'hôte, d'amoindrir ses défenses et de générer des nutriments facilement assimilables. La production de ces enzymes au cours de la pathogénèse est soumise à une régulation complexe qui intègre des signaux liés au pH du milieu extérieur, aux nutriments disponibles et à la présence de l'hôte. Afin d'élucider les mécanismes moléculaires de perception et de transmission de ces signaux, la régulation de la production de la protéase acide ACP1 a été choisie comme modèle d'étude. ACP1 est le produit d'un gène unique dont l'expression est induite au contact de l'hôte et réprimée par les pH neutres ou alcalins.
Nous avons mis en évidence qu'une phospholipase de type D intervient dans la régulation du gène acp1. L'expression de ce dernier est en effet diminuée lorsque le champignon est mis au contact d'inhibiteurs de cette enzyme. Cette inhibition n'opère pas sur la production d'autres enzymes lytiques comme les polygalacturonases et la phospholipase ne participe donc pas à la transmission d'un signal global de l'infection. L'analyse de l'expression d'acp1 en conditions variées de carence suppose plutôt que la phospholipase soit un élément essentiel de la perception du signal "soufre" par la cellule fongique.

Poster N° 16

Métabolisme du soufre et pouvoir pathogène des champignons filamenteux

M.E. Saint-Macary, A. Beaurepaire, M.H. Lebrun, M. Droux
Laboratoire mixte CNRS/Bayer Cropscience - 14-20, rue Pierre Baizet - 69009 Lyon

Les besoins nutritionnels des champignons pathogènes lors de l'interaction avec la plante sont méconnus. Un des nutriments essentiels au développement du champignon dans la plante est le soufre. Par exemple, les arylsulfatases sont des enzymes synthétisées en réponse à un besoin interne en soufre. Leur expression chez Colletotrichum gloeosporioides pendant l'infection de la mauve à feuilles rondes (Malvae pusilla) est fortement induite lors de la pénétration et régresse ensuite graduellement pendant le développement in planta (Goodwin & al., 2000). Le pathogène est donc sulfate-dépendant pendant les premiers stades de l'infection. La voie de biosynthèse du soufre chez les champignons filamenteux est complexe. La caractérisation de mutants de Neurospora crassa et Emericella nidulans indiquent que cette voie se compose à la fois de gènes appartenant au métabolisme soufré des plantes et à celui de Saccharomyces cerevisiae. Ainsi les champignons filamenteux sont capables de synthétiser de la méthionine à partir de cystéine (modèle plante ) mais aussi l'inverse (modèle levure ).
La mutation de l'ATP sulfurylase chez Cryptococcus neoformans, première enzyme de la voie d'assimilation du soufre, conduit à l'auxotrophie du champignon in vitro et à la perte du pouvoir pathogène in vivo (Yang & al., 2002). D'autre part, l'analyse de l'expression de la méthionine synthase chez Cladosporium fulvum in planta révèle une forte augmentation de cette enzyme pendant la phase d'infection (Solomon & al., 2000).
Ces expériences montrent l'implication de la voie de biosynthèse cystéine/méthionine dans le pouvoir infectieux des champignons phytopathogènes. Notre objectif est d'étudier les enzymes des voies de transsulfuration directe et inverse chez le modèle Magnaporthe grisea (cf. figure ci-dessus). Il s'agit de caractériser le rôle de ces deux voies au cours du cycle infectieux par deux approches : d'une part, l'étude de l'expression des gènes et de la localisation des enzymes et d'autre part, la création de mutants nuls pour appréhender l'impact de chacune de ces voies. Nos travaux portent sur la CGS pour la voie directe et la CGL pour la voie inverse. La co-localisation des protéines se fait par fusion avec la GFP pour la CGS et HcRed pour la CGL (en cours). Les deux constructions des mutants nuls ont été réalisées et sont en cours de transformation dans les champignons.
Goodwin & al. (2000). Physiol. Mol. Plant. Pathol., 57 : 169-176.
Yang & al. (2002). Microbiology, 148 : 2617-2625.
Solomon & al. (2000). Mol. Plant. Pathol., 1 : 315-323.

Poster N° 17

Construction of a reference microsatellite genetic map of Magnaporthe grisea and its use for mapping avirulence genes

C. Kaye(1), A. Bordat(1), Y. Wang(2), C. Li(3), T. Sreewongchai(4), S. Rosenfeld(5), P. Sirithunya(4), Y. Shen(2), M.H. Lebrun(6), D. Tharreau(1)
(1) UMR BGPI, CIRAD, TA73/09, 34398 Montpellier Cedex 05, France
(2) China National Rice Research Institute, 359 Ti Yu Chang road, 310003 Hangzhou, China
(3) Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Jiaochang East road, 650223 Kunming, China
(4) BIOTEC, Rice Gene Discovery Unit, Kasetsart University, Kamphaengsaen, Nakornpathom, 73140, Thailand
(5) Bayer CropScience, Evry, France
(6) FRE PPC, INRA-CNRS-Bayer CropScience, Lyon, France

In spite of their importance in the resistance durability phenomena, molecular mechanisms for the recognition of fungal pathogens by their host plant remain poorly understood. To date, Twelve fungal avirulence genes have been cloned , including 4 from Cladosporium fulvum and 5 from Magnaporthe grisea. The peptides encoded by these genes share no structural homology, except for their size which is generally (but not always) small. Thus, studying more avirulence genes is desirable.
The genome sequence of Magnaporthe grisea was released recently [Magnaporthe Sequencing Project. Ralph Dean, Fungal Genomics Laboratory at North Carolina State University (http://www.fungalgenomics.ncsu.edu), and Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research (http://www-genome.wi.mit.edu)]. This provides a useful tool to rapidly develop microsatellite molecular markers. Among the 1,436 microsatellite sequences identified in the genome (that were composed of di, tri and tetra nucleotides of at least 18 nucleotides), we chose 341 sequences, distributed throughout the genome, to define primers pairs allowing for their amplification by PCR. Eight percent of these primers did not amplify any product. Among the others, 43 % revealed polymorphism between the parents of a reference cross (Guy11 x 2539) as analysed on 3 % agarose gels. One hundred-thirty four microsatellite markers could be added to the existing reference map. These markers are distributed over the six chromosomes at an average distance of 10 cM.
The descendants of four crosses between different M. grisea strains were analyzed by pathology testing and 9 avirulence genes were identified. The reference microsatellite map was used to choose markers that allowed us to map them in the new crosses or to increase the density of markers in areas surrounding the avirulence genes. In most cases, when comparing the location of markers in different crosses, the order of markers and distances between markers were conserved. Some evidence for rearrangements were, however, found.
The use of a reference microsatellite map turned out to be very rapid and very efficient for the construction of framework genetic maps and rough mapping of a gene. For example, for a new cross for which no information was known, we could construct in just 3 weeks, a framework map using 94 progeny and 52 markers covering the 6 chromosomes. Since the genome sequence is available, increasing the number of markers in one particular area should become relatively easy.