Session : Genomiques des Champignons



Poster n° 1


Construction de mutants optimisés pour la recombinaison homologue chez Botrytis cinerea

M. Choquer, C. Levis, M. Viaud

INRA Centre de Versailles-Grignon, PMDV, Rte de St-Cyr, 78086 Versailles


Botrytis cinerea est un des principaux champignons pathogènes de la vigne. Il est responsable de pertes estimées entre 15-40% des récoltes selon les conditions climatiques pour la viticulture française. Ce champignon également connu pour sa grande polyphagie (>200 plantes hôtes) sert de modèle d’étude du processus infectieux. L’utilisation de fongicides demeure le meilleur moyen de lutte contre ce champignon, mais l’apparition de souches résistantes au champ nous contraint à rechercher de nouvelles cibles antifongiques.

Notre équipe participe au pilotage du projet génome de B. cinerea et se focalise sur son analyse fonctionnelle. A l’issue du séquençage du génome, réalisé au Genoscope, les analyses de génomique comparative et de transcriptome vont permettre d’identifier un ensemble de gènes potentiellement impliqués dans le processus infectieux ou encodant des fonctions cellulaires d’intérêt, et qui seront analysés par génétique inverse. Cependant, les techniques classiques de transformation des champignons filamenteux ne permettent pas d’obtenir plus de 20% de recombinaison homologue chez B. cinerea ce qui rend difficile l’obtention de mutants à un locus souhaité. Il apparaît indispensable de développer une solution alternative permettant de réduire la fréquence d’apparition des insertions ectopiques. Ceci permettrait également de pouvoir aller jusqu’à l’inactivation de plusieurs gènes en simultané, et d’obtenir par exemple des doubles ou des triples mutants en n’effectuant qu’une seule transformation. Nous nous proposons dans cet objectif de construire une souche mutante de B. cinerea qui serait optimisée pour la recombinaison homologue et qui servirait de souche réceptrice pour inactiver d’autres gènes comme cela a été récemment décrit chez Neurospora crassa (Ninomiya et al., 2004) et reproduit chez Magnaporthe grisea (MH. Lebrun, Comm. Pers.).

Chez les eucaryotes, les cassures double-brin de l’ADN (DSBs : DNA Double-Strand Breaks) sont réparées par deux mécanismes principaux : la jonction précise ou imprécise des extrémités (NHEJ : Non Homologous End Joining) et la recombinaison homologue (RH). Alors que la RH est majoritaire chez la levure, les deux mécanismes sont en compétition plus étroite chez les mammifères comme chez les champignons filamenteux. Les deux protéines KU70 et KU80, initialement identifiées chez l’homme, forment un hétérodimère capable de se lier aux DSBs et d’y recruter un complexe de protéines nécessaire au NHEJ. L’inactivation des gènes homologues à Ku70 et à Ku80 chez N. crassa a permis de supprimer la NHEJ et d’obtenir le résultat surprenant de 100% de RH chez ces mutants. Nous avons donc opté pour la même stratégie chez Botrytis cinerea, et les résultats obtenus seront discutés dans ce poster.

Référence :

Ninomiya Y, Suzuki K, Ishii C, Inoue H. (2004) Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. Proc Natl Acad Sci USA. 101 : 12248-53.