Session : Interactions Moléculaires



Poster n° 1


Distribution and origin of the rice blast resistance gene Pi33

E. Ballini (1), R Berruyer (1), A. Bordat (1), E. Vergne (1), J.B. Morel (1), M.-H. Lebrun (2), J.- L.Nottéghem (1), D. Tharreau (1)

(1) CIRAD – UMR BGPI, TA 41 / K, Campus International de Baillarguet,34398 Montpellier Cedex 5
(2) CNRS
Bayer CropScience, BP 9163, 63623 Lyon


Few reports on the distribution of resistance genes to plant pathogens within a species are available. Because of its genetic structuration, Oryza sativa can be an interesting model for such a study. We were interested in the interaction between the resistance gene to blast Pi33 and its corresponding avirulence gene ACE1. Although Pi33 was not cloned, its allele(s) conferring resistance can be identified by inoculation of pairs of isogenic strains of Magnaporthe grisea differing only for ACE1.

One-hundred-eighty-three varieties of O. sativa were inoculated with isogenic strains. Twenty-three varieties of the Indica subspecies (mainly modern semi-dwarf varieties) carrying a resistance allele of Pi33 were identified representing 21,6 percent of the Indica varieties tested. None of the 45 Japonica varieties tested carried the resistance allele.

In order to identify the original donors of Pi33, the genealogies of the varieties carrying Pi33 were examined. In addition, 28 parental lines from IR64 were tested to seek the donor of resistance for this variety. Two possible origins of resistance could be identified: Tsai Yuan Chung and the wild rice O. rufipogon. These two candidates were confirmed as possible sources of resistance by genotyping and sequencing. It appears that both resistance sources  were commonly used in breeding programmes leading to modern semi-dwarf Indica varieties.

The presence of Pi33 in O. rufipogon led us to the hypothesis that Pi33 existed before domestication. This hypothesis was confirmed by the detection of Pi33 in O. latifolia (CCDD genome), O. barthii (AA) and diverse accessions of O. rufipogon (AA).



Poster n° 2


Cloning of Pi33, the rice resistance gene corresponding to the cloned avirulence gene ACE1 of Magnaporthe grisea

E. Ballini (1), A. Bordat (1), E. Vergne (1), J.B. Morel (1), M.-H. Lebrun (2), J.- L.Nottéghem (1), D. Tharreau (1)

(1) CIRAD – UMR BGPI, TA 41 / K, Campus International de Baillarguet,34398 Montpellier Cedex 5
(2) CNRS
Bayer CropScience, BP 9163, 63623 Lyon


The Oryza sativa-Magnaporthe grisea pathosystem is of economic importance but it is also a model for the plant-fungus interaction studies. A gene-for-gene system was described for this pathosystem. However, the number of specific interactions characterized at the molecular level is still restricted. After cloning the avirulence gene ACE1 of M. grisea (Böhnert et al. 2004, Plant Cell), we undertook the positional cloning of the corresponding resistance gene Pi33.  Pi33 was localised on chromosome 8 of rice in two independent crosses (Berruyer et al. 2003, TAG).  A fine mapping allowed us to place the gene between two markers distant of 240 kb.  In this area, a cluster of 9 candidate genes was identified by analysis of the sequence of Nipponbare (which is deprived of Pi33). This analysis was confirmed by the sequencing of two BAC clones covering the same region in IR64 (which carries a resistance allele of Pi33). To identify the gene among the candidates, several strategies were developed. Silencing experiments by RNAi were started. Partial sequences of the different candidates were compared between varieties with or without Pi33. Polymorphism of flanking markers was also characterized. Finally, expression of the candidates was measured by RT-PCR in varieties with or without Pi33.




Poster n° 3


Production de mycotoxines par Fusarium graminearum : effets du pH sur la biosynthèse des trichothécènes

C. Barreau (1), C. Bernarde (1), A.-L. Boutigny (2), N. Ponts (1), L. Pinson-Gadais (1), F. Richard-Forget (1)

(1) INRA Centre de Bordeaux, UR 1264 MycSA, BP 81, 71 rue Edouard Bourleaux, 33883 Villenave d’Ornon Cedex
(2) IRTAC, 67, boulevard Richard Lenoir, 75001 Paris


Les champignons pathogènes du genre Fusarium sont des agents responsables de graves épidémies de fusariose sur céréales et maïs. Outre les dégâts et pertes de rendements provoqués, ces microorganismes sont capables de produire des mycotoxines qui peuvent rendre les récoltes impropres à la consommation. La réglementation européenne qui entrera en vigueur en 2007 (Règlement (CE) N° 856/2005 de la Commission du 6 juin 2005) va imposer des seuils de contamination pour les différents produits céréaliers.

Le contrôle des épidémies de fusariose par lutte chimique est difficile et coûteux et ne peut garantir, avec les molécules existantes actuellement, la production de céréales indemnes de toxines ou du moins en deçà des seuils exigés par la réglementation. En l’absence de procédés de décontamination applicable, il est nécessaire d’agir en amont, c'est-à-dire de pouvoir limiter la production de fusariotoxine au champ. Les connaissances sur la biosynthèse des mycotoxines et surtout, sur les facteurs capables de limiter la production de toxines au champ sont limitantes. Une approche in vitro doit, dans un premier temps, permettre de déterminer quels sont les facteurs décisifs dans la régulation de la biosynthèse des mycotoxines par ces microorganismes et éventuellement, de découvrir de nouvelles cibles pour lutter contre l’occurrence de toxines dans les céréales.

Fusarium graminearum, l’espèce la plus fréquemment retrouvée aussi bien sur blé que sur maïs, est responsable de la contamination par des trichothécènes de type B (TCT B). La voie de biosynthèse de ces métabolites secondaires est mieux connue aujourd’hui, et l’accès aux gènes « Tri » impliqués permet de mieux comprendre les mécanismes régulant leur biosynthèse. Nous nous sommes intéressés dans notre étude aux fluctuations du niveau de biosynthèse des TCT B dues aux variations du milieu de culture du champignon. L’influence de ces conditions semble un facteur important pour l’induction de la biosynthèse. En particulier, nous avons étudié l’effet de l’évolution du pH du milieu sur la production de toxine et sur l’induction du gène Tri5, premier gène de la voie de biosynthèse des TCT B chez F. graminearum. Les résultats obtenus suggèrent qu’un changement brusque du pH est capable d’induire l’expression du gène Tri5 et la biosynthèse des TCT B. Des boites correspondant à la séquence consensus 5’GCCARG3’ de fixation du facteur PacC contrôlant le pH chez Aspergillus sont présentes dans les promoteurs de plusieurs gènes « Tri » et en particulier des gènes régulateurs Tri6 et Tri10. Ceci pointe le doigt vers un rôle possible du facteur de contrôle de l’homéostasie du pH dans la régulation de l’expression des gènes de la voie de biosynthèse des trichothécènes.



Poster n° 4


Signature métabolique du pathosystème Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pv tomato: une aide à la génomique fonctionnelle de la résistance induite chez les plantes

F. Bellvert, M. Langlois-Meurinne, C. Gachon, P. Saindrenan

Institut de Biotechnologie des Plantes, CNRS-Université Paris-Sud, Bât. 630, 91405 Orsay Cedex


La réaction d’hypersensibilité (HR) est la forme de résistance induite aux agents pathogènes la plus efficace chez les plantes. La HR est accompagnée d’une profonde re-programmation du fonctionnement de la plante vers les défenses qui peut être visualisée au niveau du transcriptome, du protéome ou du métabolome de l’interaction. La génomique fonctionnelle ayant pour but de préciser le lien entre la fonction d’un gène et le phénotype observé, la métabolomique a pour ambition d’appréhender qualitativement et quantitativement les variations d’un nombre important de métabolites cellulaires fournissant ainsi une vue globale du statut biochimique d’un organisme qui peut expliquer ce phénotype. Au cours de la HR d’Arabidopsis thaliana infectée par Pseudomonas syringae pv tomato, le métabolisme secondaire de la plante est fortement activé entraînant l’accumulation ou la diminution d’un nombre important de métabolites. La signature métabolique du pathosystème considéré a été réalisée par profilage métabolique sur l’écotype Columbia et le mutant pad3 affecté dans la biosynthèse de la camalexine. Les variations dans les teneurs en dérivés phénylpropanoïdes, indoles et flavonoïdes seront présentées et discutées en relation avec les phénotypes respectifs des plantes.



Poster n° 5


Diversité des systèmes de défenses de la Vigne en réponse à des éliciteurs biotiques et abiotiques

J. Bouscaut
(1), S. Hamdi.(2), J.-M. Mérillon (3)? M.-F. Corio-Costet (1)

(1) UMR 1065 Santé Végérale, INRA-Bordeaux, BP 81, 33883 Villenave d'Ornon
(2) UMR PBV- IBVM-INRA-Bordeaux
(3) UFR des Sciences Pharmaceutiques-Bordeaux



Les principaux pathogènes de la Vigne, Erysiphe necator et Plasmopara viticola, deux parasites biotrophes stricts, nécessitent une lutte chimique systématique afin de contenir leur développement épidémique.

En absence de méthodes standardisées afin d’évaluer l’efficacité d’inducteurs des défenses de la Vigne sur le développement des pathogènes, une méthodologie spécifique à chaque pathogène a été définie. Nos études montrent que Plasmopara viticola semble être plus sensible que Erysiphe necator à une élicitation extemporanée des défenses de la Vigne, réalisée par du BTH, du PK2 ou du Fosétyl d’aluminium. De plus, la diversité de l’oïdium intergroupe montre que les souches de biotype B (hivernant sous forme sexuée) sont plus sensibles aux défenses de la plante que les souches de biotype A (hivernant sous forme asexuée).

Des analyses biochimiques, par HPLC, d’extraits de composés polyphénoliques issus de feuilles de Vigne stimulées ou inoculées, ont conduit à l’obtention de profils chromatographiques particuliers selon la modalité considérée. Ainsi, les composés phénoliques synthétisés, ou accumulés, sont caractéristiques du pathogène (comme la synthèse de resvératrol suite à une attaque par Plasmopara viticola) ou de la nature de l’inducteur. 

Enfin, afin de corréler les résultats précédents avec les niveaux d’induction de gènes inhérents aux voies de défenses et de biosynthèse des anthocyanes, une approche moléculaire, par RT-PCR semi quantitative, a été réalisée. Outre une signature moléculaire se révélant être caractéristique du pathogène considéré, les profils d’induction des gènes observés se présentent être également représentatifs de l’éliciteur considéré.

Ainsi, la spécificité de réponse de la Vigne, selon l’induction, doit être prise en compte pour le développement de l’utilisation de stimulateurs des défenses naturelles de la Vigne.

Mots clés : Erysiphe necator, Vitis vinifera, éliciteur, polyphénols, défenses des plantes, expression de gènes, protocole standardisé.



Poster n° 6


Modulation de la biosynthèse des trichothécènes B de Fusarium par les acides phénoliques

A.-L. Boutigny (1) (2), N. Ponts (2), L. Pinson-Gadais (2), V. Atanasova-Penichon (2), C. Barreau (2), F. Richard-Forget (2)

(1) IRTAC, 67 boulevard Richard Lenoir - 75011 Paris
(2) INRA, Centre de Bordeaux, UR MysSa, 71, avenue Edouard Bourleaux, 33883 Villenave d'Ornon Cedex



La présence du champignon microscopique Fusarium sur les céréales entraîne des pertes de rendement aux champs et une altération de la qualité des grains. Certaines espèces de Fusarium sont susceptibles de synthétiser des mycotoxines, métabolites secondaires toxiques, qui s’accumulent dans les grains. Du fait de la présence de mycotoxines dans les grains, et compte tenu des quantités journalières de céréales consommées, un problème de santé publique est soulevé. Fusarium culmorum et fusarium graminearum sont les principales espèces toxinogènes sur blé en Europe. Parmi les mycotoxines produites par Fusarium, on retrouve essentiellement les trichothécènes de type B qui sont décrits comme très thermostables et sont donc difficiles à éliminer lors des procédés agro-alimentaires. Leur biosynthèse n’est pas ou très peu maîtrisable au champ. Actuellement, la seule alternative pour réduire la présence des mycotoxines de Fusarium dans les céréales est d’agir au champ, en amont de leur biosynthèse. Le choix variétal est un des facteurs susceptibles de moduler les niveaux de contamination des grains. Si des variétés résistantes à la fusariose ont été identifiées chez le blé tendre, ce n’est pas le cas pour le blé dur. Cependant, il a été montré l’existence d’une gamme de sensibilité à la mycotoxinogenèse chez le blé dur. Ces différences de sensibilité pourraient être liées à des compositions biochimiques différentes. Parmi les composés du grain susceptibles de moduler la biosynthèse des trichothécènes de type B, les acides phénoliques, majoritairement présents dans les sons de blé sous forme libre ou liée aux parois cellulaires, sont fortement suspectés. Lors de l’infection du grain de blé par Fusarium, les acides phénoliques, liés dans des complexes polysaccharidiques, seraient progressivement libérés sous l’action d’enzymes fongiques ou de la plante en réponse à l’infection. Dans ce contexte, l’étude in vitro de l’effet de différents acides phénoliques (acides férulique, p-coumarique, vanillique, caféique, syringique, p-hydroxybenzoïque et protocatéchuic) sur les niveaux de production de trichothécènes B par 9 souches de Fusarium d’espèce et de chémotype différents a été menée. Les résultats obtenus montrent que ces composés ont un effet modulateur de la mycotoxinogenèse, inhibiteur ou activateur selon l’acide phénolique et selon la souche de Fusarium considérée. Les acides phénoliques auraient donc un rôle éventuel en tant que modulateurs des voies de biosynthèse des mycotoxines et pourraient être éligibles comme marqueurs de sélection dans le criblage de variétés de blé dur moins sensibles à la mycotoxinogenèse.



Poster n° 7


Régulation soufre chez le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea

O. Frelin, G. Billon-Grand, M. Fèvre, G. Mey

Laboratoire de Génétique et Microbiologie, UMR 5122, Université Lyon 1, 10 rue Dubois, 69622 Villeurbanne


Le soufre occupe une place fondamentale dans le cycle de vie des cellules eucaryotes. L’assimilation de l’ion sulfate et son incorporation dans les composés organiques conduit à la synthèse des deux acides aminés soufrés, la cystéine et la méthionine nécessaires à la synthèse protéique. La cystéine est aussi un donneur de soufre pour la synthèse de nombreux composés essentiels comme le glutathion, les vitamines et les cofacteurs. La méthionine est à l’origine de la S-adénosylméthionine (AdoMet), indispensable à toutes les réactions de méthylation dans la cellule et à la synthèse des polyamines. A l’instar des sources de carbone et d’azote, les composés soufrés sont à l’origine d’une cascade de signalisation spécifique, étudiée essentiellement chez la levure et les champignons filamenteux modèles Neurospora crassa et Aspergillus nidulans.

L’objectif de notre travail est de définir les mécanismes de la régulation soufre dans le contrôle de l’assimilation des composés soufrés, en particulier la synthèse des enzymes sécrétées, par l’agent de la pourriture grise Botrytis cinerea.

D’une part, l’existence d’une régulation par les composés soufrés extracellulaires a été étudiée à l’aide de deux systèmes reporteurs : 1- analyse par PCR quantitative de l’expression du gène BcMup1, codant pour un transporteur de méthionine ; 2- mise en évidence d’une sérine protéase dans le milieu extracellulaire, par dosage de son activité enzymatique et par Western blot.

D’autre part, le gène codant pour l’activateur BcCys3, impliqué dans la régulation de l’assimilation du soufre chez les champignons, a été isolé par marche chromosomique et ensuite inactivé par une approche utilisant le RNAi. L’impact de l’extinction du gène BcCys3 sur le métabolisme du soufre a été apprécié par la mesure de l’expression des systèmes reporteurs et la mesure de différents métabolites soufrés intracellulaires (dosage HPLC).

Ces différentes approches sont une introduction dans la compréhension du rôle physiologique de la cystéine, de la méthionine et du facteur de transcription (BcCys3) dans la régulation de l’exploitation des composés soufrés par le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea.



Poster n° 8


Etude de l’impact des Hydrocarbures Polycycliques Aromatiques (HPA) sur la symbiose endomycorhizienne en condition monoxénique

A. Lounès-Hadj Sahraoui (1), A. Grandmougin-Ferjani (1), E. Dumas-Gaudot (2), R. Durand (1)

(1) Laboratoire de Mycologie – Phytopathologie – Environnement, Université du Littoral Côte d’Opale, 17, avenue Blériot, BP 699, 62228 Calais Cedex
(2) UMR 1088 INRA/CNRS 5184/UB (Plante-Microbe-Environnement), INRA-CMSE, BP 86510, 21065 Dijon Cedex


Les HPA, contaminants ubiquistes dans l’environnement, sont produits par les combustions incomplètes durant des processus naturels (éruption volcanique, feux de forêts) ou lors d’activités anthropiques diverses (chauffage, production de coke, transport routier et fluvial). De nombreuses plantes cultivées sont en contact permanent avec les HPA. Ces composés présentent une certaine phytotoxicité s’exprimant différemment suivant l’espèce végétale et les conditions environnementales. De plus, leur accumulation dans les plantes cultivées constitue un risque potentiel de contamination de la chaîne alimentaire.

La majorité des plantes vasculaires établissent des relations symbiotiques avec les champignons endomycorhiziens à arbuscules (EA) et en tirent de nombreux bénéfices : meilleure nutrition hydrique et minérale, meilleure résistance aux stress biotiques ou abiotiques... Le but de ce travail est d’étudier l’impact de ces polluants sur les partenaires de la symbiose endomycorhizienne et d’élucider le devenir de ces polluants au sein de l’association.

Les champignons EA sont des organismes biotrophes obligatoires mais néanmoins cultivables in vitro, en culture monoxénique. Récemment, des études réalisées au laboratoire, ont montré que Glomus intraradices, cultivé en présence de racines transformées de chicorée, était capable de se développer dans un milieu pollué par de l’anthracène et de s’y multiplier. En dépit de la réduction du développement des hyphes extraracinaires, de la colonisation racinaire et de la germination des spores, nous avons montré que ce champignon EA augmentait la tolérance des racines hôtes aux HPA et que ces polluants s’accumulaient à la fois dans les globules lipidiques des cellules végétales et fongiques. Afin de tenter d’identifier certaines réponses physiologiques au stress subit par les champignons endomycorhiziens et leur partenaire végétal cultivés en présence d’HPA, nous avons initié des recherches orientées d'une part, sur le métabolisme protéique (approche protéomique) et lipidique.



Poster n° 9


Recherche de gènes impliqués dans le pouvoir protecteur des Fusarium oxysporum par hybridation soustractive rapide (RaSH)

F. L’Haridon
, S. Aimé, C. Olivain, C. Alabouvette

UMR Microbiologie et Géochimie des sols, INRA/Université de Bourgogne, CMSE, 17 rue Sully, BP 86510, 21065 Dijon Cedex


Les Fusarium oxysporum sont des champignons ubiquistes dans les sols. De nombreuses souches sont des agents de trachéomycoses et présentent une spécificité d’hôte étroite. Il a été démontré que les souches pathogènes d’une espèce végétale donnée, inoculées à une autre espèce lui confèrent une résistance vis-à-vis de sa fusariose spécifique. La souche Fom24, pathogène spécifique du melon protège la tomate contre sa fusariose. Un mutant  de Fom24 (rev.157) obtenu par mutation insertionnelle a perdu sa capacité à protéger la tomate. Nous avons utilisé ces deux souches pour analyser les gènes différentiellement exprimés lors des interactions cellules de tomate/souche protectrice ou non protectrice. Le but de cette étude est de rechercher des gènes ayant un rôle essentiel dans le pouvoir protecteur des souches de Fusarium oxysporum. Nous avons développé un système in vitro mettant en présence des conidies germées de F. oxysporum et des cellules en culture pour analyser l’expression des gènes dans les premières heures de l’interaction. L’analyse est effectuée par la technique d’hybridation soustractive rapide (RaSH). Après extraction des ARN totaux dans les couples Fom24/cellules de tomate et rev.157/cellules de tomate, les ADNc sont synthétisés. Les ADNc du couple Fom24/cellules de tomate sont soustraits à ceux du couple rev.157/cellules de tomate et inversement. Sur une cinétique d’interaction de 30 min à 12 h, 56 séquences d’ADNc correspondant à des gènes différentiellement exprimés ont été isolées : 34 lors de l’interaction souche protectrice (Fom24)/cellules de tomate et 22 lors de l’interaction mutant non protecteur (rev.157)/cellules de tomate. Les séquences obtenues ont été comparées avec celles connues dans les banques de données. Les gènes surexprimés lors de l’interaction Fom24/cellules de tomate ont une correspondance majoritaire avec des gènes fongiques (24 séquences) et seulement 1 correspond à un gène de plante. En revanche les gènes surexprimés lors de l’interaction rev.157/cellules de tomate ont une correspondance majoritaire avec des gènes de plante (15 séquences) et seulement 3 ont une homologie avec des gènes fongiques. Deux séquences ayant une homologie avec des gènes de défense de plante : une endochitinase et une polyubiquitine ont été sélectionnées. Par Northern blot, nous avons vérifié le niveau d’expression de ces 2 gènes au cours de l’interaction cellules de tomate/souche protectrice et non protectrice. Pour l’endochitinase ainsi que pour la polyubiquitine nous observons une surexpression lors de l’interaction  souche non protectrice (rev.157)/cellules de tomate. Par contre il existe une inhibition de l’expression de ces deux gènes lors de l’interaction souche protectrice (Fom24)/cellules de tomate. Ce sont les premiers résultats mettant en évidence une inhibition de certains gènes de défense dans le cas de la protection conférée par des souches protectrices de F. oxysporum. Les travaux ultérieurs visent à isoler les gènes fongiques surexprimés précocément lors des 2 types d’interaction.



Poster n° 10


Formation of calcium oxalate crystals and increased levels of oxalate in tomato tissues infected by Crinipellis perniciosa, the Witches’ Broom pathogen of Theobroma cacao

J.-P Marelli (1), S. Kang (1), S. Maximova (2), P. Backman (1) K.P. Gramacho (3), and M.J. Guiltinan (2)

(1) Depts. Plant Pathology and (2) Horticulture, Penn State University, University Park PA 16802, UNITED KINGDOM
(3) CEPLAC/CEPEC/SEFIT, Itabuna, BA, BRAZIL


The fungal pathogen Crinipellis perniciosa causes Witches’ Broom disease on Theobroma cacao, and has devastated the production of cacao beans in South America. One of the main barriers to developing effective control measures is the limited understanding of the mechanisms by which the pathogen produces disease symptoms. A surrogate model of the pathosystem was developed using the solanaceous biotype of C. perniciosa that can infect tomato (Lycopersicon esculentum).  Following the same synchrony as in T.cacao, infected tomato plants show symptoms 30 days after inoculation (DAI) in the form of stem and petiole swelling and activation of axillary meristems, corresponding to the establishment of the  biotrophic phase.

To characterize this interaction at the cellular level, cross sections of diseased tissue were embedded in paraffin, sectioned and stained. Diseased tissues showed hypertrophy and hyperplasia of the vascular tissue and the cortical cells. Intercellular,   biotrophic hyphae of  C. perniciosa was found mainly in the cortex but was also present in the vascular tissue and in the pith. Interestingly, the biotrophic hyphae was often associated with calcium oxalate crystals that were produced in the inter-cellular spaces.

Levels of oxalic acid in infected plants 33, 41 and 48 DAI were analyzed using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. In diseased tomato tissue the levels of oxalic acid were respectively 50% and 65% higher 33 and 41 DAI comparatively to the non inoculated controls. The levels were not significantly different at 48 DAI which also corresponded to necrosis and yellowing of the growing tips.

The implication of oxalic acid in the interaction between C. perniciosa and Lycopersicon esculentum could have a very important role in the establishment of the biotrophic interaction by inactivating plant defense responses and sequestering cell wall calcium. Preliminary data shows that crystals are also present in infected tissue of T. cacao.



Poster n° 11


Transformation génétique du champignon endomycorhizien éricoïde métallo-tollérant Oidiodendron maius

E. Martino (1),
M. Vallino (1), M. Pitet (1), C. Murat (1), P. Spanu (2), P. Bonfante (1), S. Perotto (1)

(1) Dipartimento Biologia Vegetale, Università degli Studi di Torino, Viale Mattioli 20, 10125 Torino, ITALIE
(2) Department of Biological Sciences, Imperial College London, UNITED KINGDOM


Les champignons éricoïdes colonisent les racines des plantes appartenants à lordre des Ericales et jouent un rôle important dans la nutrition minérale des plantes hôtes ainsi que sur leur résistance à des concentrations élevées en métaux lourds. Au sein de notre laboratoire nous avons déjà identifié plusieurs gènes qui semblent être impliqués dans la résistance aux métaux du champignon Oidiodendron maius. La construction de souches fongiques knock-out permettrait de vérifier leur rôle. Parmi les champignons mycorhiziens, il existe plusieurs espèces ectomycorhiziennes pour lesquelles un protocole de transformation est disponible, toutefois, au début de ce travail la transformation des champignons endomycorrhiziens (arbusculaires et éricoïdes) n’était pas encore possible.

Lobjectif de cette étude est la mise au point dun protocole de transformation stable du champignon endomycorrhizien éricoïde O. maius. Pour cela, la souche fongique O. maius Zn a été sélectionnée pour sa tollérance aux métaux lourds. Deux protocoles de transformation ont été testés : un utilisant la réalisation de protoplastes et  lautre en utilisant Agrobacterium tumefaciens.

Les protoplastes ont été transformés par le plasmide fongique pAN7-1, il a aussi été réalisé une co-transformation pAN7-1 et un plasmide portant le gène codant lEGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein). La transformation par A. tumefaciens a été réalisée avec les souches bactérennes LBA 1100 et LBA 1126. Les plasmides pUR5750 et pBIN7-1, contenant une région codante du gène de résistance à lhygromycine controllée par le promoteur GPD dAspergillus nidulans, ont été  respectivement utilisés comme vecteurs. La vérification de lintégration dans le génome fongique du vecteur a été testé par PCR et Southern Blot.

Les deux protocoles ont permit lobtention de transformants stables après reproduction végétative. Les analyses Southern Blot ont montré que la plupart des transformants obtenus par A. tumefaciens ne comportent quune seule insertion. Par contre, le protocole utilisant les protoplastes a produit majoritairement des transformants ayant plus dune insertion. La mise en contact de souches exprimant lEGFP et des plants de myrtilles a permit la réalisation dendomycorhizes dans lesquelles la  Green Fluorescent Protein sexprime dans les filaments fongiques, permettant ainsi de suivre précisément linvasion des racines par les champignons.

En conclusion, cette étude représente la première mise au point dun protocole de transformation stable dun champignon endomycorrhizien. Dautre part, nous avons réalisé, pour la première fois, des photos dans lesquelles il est possible de visualiser lexpression de la Green Fluorescent Protein dans les filaments fongiques lors de la symbiose endomycorhizienne.



Poster n° 12


Identification de gènes fongiques nécessaires à l’établissement de la symbiose entre le champignon ectomycorhizien Hebeloma cylindrosporum et son hôte, le pin maritime

D. Melayah
, J.-P. Combier, C. Raffier, R. Marmeisse, G. Gay

Université Claude Bernard Lyon ,  UMR CNRS 5557 d’Ecologie Microbienne, 43 Boulevard du 11 Novembre, 69622 Villeurbanne Cedex


L’identification des fonctions géniques essentielles à l’établissement  des interactions symbiotiques ectomycorhiziennes est un challenge majeur de la prochaine décennie. Chez les champignons ectomycorhiziens, des répertoires de gènes différentiellement exprimés au cours du processus symbiotique ou exprimés spécifiquement dans la structure mycorhizienne ont été identifiés et sont des candidats potentiels à l’identification de gènes du « pouvoir symbiotique ». En l’absence de systèmes permettant une investigation, à large échelle, du rôle de ces gènes dans la symbiose ectomycorhizienne, et parce que la fréquence des évenements de recombinaison homologue dans les génomes d’espèces ectomycorhiziennes n’est à ce jour pas connue, une stratégie alternative  repose sur la caractérisation moléculaire de mutants fongiques affectés dans le processus symbiotique.

Une collection d’environ 2000 souches du champignon ectomycorhizien Hebeloma cylindrosporum a été obtenue par mutagénèse insertionnelle de l’ADN-T suite à la transformation de H. cylindrosporum par Agrobacterium tumefaciens. L’analyse des phénotypes d’interaction de ces agro-transformants vis-à-vis de l’hôte habituel, le pin maritime a révélé deux classes majoritaires de mutants : ceux pour lesquels le processus symbiotique est fortement altéré (18 mutants) et ceux totalement non mycorhiziens (2 mutants). Tous les mutants caractérisés présentent une intégration unique de l’ADN-T dans leur génome, suggérant que cette insertion est sans doute à l’origine du phénotype. L’analyse moléculaire des sites d’intégration de l’ADN-T des mutants indique que les intégrations de l’ADN-T se produisent aléatoirement dans le génome de H. cylindrosporum, avec toutefois un schéma préférentiel (plus de 75 % des cas) dans les séquences  régulatrices amont des gènes (promoteur ou 5’ UTR). Par ailleurs, le séquençage des bordures génomiques des insertions nous fournit l’information nécessaire pour cloner les allèles sauvages des gènes inactivés. À terme, la caractérisation moléculaire des mutants, couplée à l’analyse de leur transcriptome, pourra nous fournir une vision globale des grandes fonctions impliquées et régulées lors de l’établissement de la symbiose.



Poster n° 13


Validation d’une méthode de phénotypage réalisée sur disques foliaires pour l’étude de la résistance de la vigne au mildiou

S. Merdinoglu (1), P. Coste (1), R. Eibach (2), D. Merdinoglu (1)

(1) UMR INRA-ULP Santé de la Vigne et Qualité du Vin. F - 68021 Colmar Cedex
(2) BAZ-Institut for Gravepine Breeding,
Geilweilherhof. D - 76833 Siebeldingen


Tous les cépages de vigne traditionnels, appartenant à l'espèce Vitis vinifera, nécessitent de l’ordre de 8 à 12 traitements phytosanitaires par an pour contrôler le mildiou, une des principales maladies foliaires. Le mildiou est causée par l'oomycète Plasmopara viticola. Ces traitements ont des conséquences économiques, sur la qualité des vins, sur l'environnement et sur la santé humaine. Un enjeu socio-économique majeur réside donc dans l’obligation de développer une viticulture limitant fortement les applications de fongicides et plus respectueuse de l’environnement. Une des voies pour répondre à cet enjeu est la création de variétés de vigne résistantes au mildiou. Bien que V. vinifera soit sensible au mildiou, de nombreuses sources de résistance existent dans les espèces du genre Vitis et dans l'espèce Muscadinia rotundifolia ce qui permet d'envisager la construction de  nouvelles variétés par une stratégie de pyramidage de gènes ou de QTLs de résistance.

La démarche consiste à réaliser un inventaire des sources de résistance disponibles afin d’identifier des sources de résistance potentielles. Le déterminisme génétique de la résistance de chaque source ainsi choisie est alors étudié à l’aide d’une population ségrégante issue d’un croisement entre le parent résistant et un parent sensible par génotypage et phénotypage de chaque individu. L’évaluation phénotypique de populations d’étude destinées à la cartographie génétique et à la cartographie fine de gènes et de QTLs de résistance présente des contraintes biologiques et méthodologiques importantes comme la taille importante des effectifs, la disponibilité d’un ensemble d’outils d’évaluation de la résistance et l’interaction avec une résistance ontogénique.

Dans cet objectif, nous avons développé une méthode de phénotypage en condition contrôlée de laboratoire réalisée sur des disques foliaires, inoculés artificiellement par un inoculum d’agressivité connue. Le stade de développement de la plante, l’étage des feuilles prélevées, les conditions d’inoculation du pathogène, les conditions d’incubation ont été définies afin d’obtenir une bonne reproductibilité des résultats. Une quinzaine de paramètres de résistance de type qualitatif, semi-quantitatif et quantitatif liés principalement à la sporulation du pathogène et à la réponse nécrotique de la plante ont été développés.

Afin de valider cette méthode, nous avons testé une population de 150 génotypes issue d’un croisement entre deux parents partiellement résistants. Cette population a été évaluée sur plusieurs années, en conditions naturelles d’infection au vignoble, en Allemagne. Ces données sont comparées aux données de phénotypage obtenues d’une part avec la méthode utilisant des disques foliaires et d’autre part avec une méthode pour laquelle des plantes entières ont été conduites dans les mêmes conditions d’inoculation et d’incubation que la méthode décrite ci-dessus. Les mêmes critères d’évaluation ont alors été utilisés.



Poster n° 14


Vers la caractérisation d’un gène du champignon Hebeloma cylindrosporum,  indispensable dans l’établissement de la symbiose ectomycorhizienne

C. N’Gari-Olémi,
D. Melayah, P. Rasooli, C. Raffier, R. Marmeisse, G. Gay

Université Claude Bernard Lyon ,  UMR CNRS 5557 d’Ecologie Microbienne, 43 Boulevard du 11 Novembre, 69622 Villeurbanne Cedex


Les interactions symbiotiques entre les racines des arbres avec les champignons ectomycorhiziens jouent un rôle majeur dans le fonctionnement des écosystèmes forestiers tempérés, en permettant, entre autres, d’améliorer la nutrition des plantes et en stimulant ainsi leur croissance. Ces symbioses nécessitent la différenciation d’ectomycorrhizes, nouveaux organes où les deux partenaires interagissent afin de permettre des échanges nutritionnels bidirectionnels. La formation des ectomycorhizes est un processus hautement régulé impliquant des bouleversements profonds de l’expression des génomes des deux partenaires. Pour identifier les fonctions géniques recrutées lors de la formation de ces structures, une collection de mutants insertionnels a été obtenue au laboratoire, par transformation du champignon Hebeloma cylindrosporum par Agrobacterium tumefaciens.

Le criblage phénotypique de ces transformants a permis d’identifier des mutants non mycorhiziens. La caractérisation phénotypique et moléculaire de l’un d’eux est en cours et sera présentée ici. Ce mutant présente une seule intégration de l’ADN-T dans son génome. Les séquences flanquant l’ADN-T ont été amplifiées par TAIL-PCR et par « vectorette », ce qui a permis de caractériser le site d’insertion et de montrer que contrairement à la région LB, une partie de la région RB de l’ADN-T n’a pas été conservée lors de l’insertion. Les étapes suivantes de la caractérisation moléculaire viseront à pleinement identifier le gène inactivé. La caractérisation phénotypique en cours permettra de préciser à quel stade du processus symbiotique ce mutant est bloqué.



Poster n° 15


Etude du rôle d’une F-box dans les mécanismes de défense chez Vitis vinifera et Arabidopsis thaliana

S. Paquis, A.-L. Varnier, S. Dorey, F. Mazeyrat-Gourbeyre, S. Dhondt-Cordelier, C. Clément, F. Baillieul

Laboratoire de Stress, Défenses et Reproduction des Plantes, URVVC  EA 2069, Université de Reims, BP 1039, 51687 Reims Cedex 2


Une approche de differential display sur le modèle d’interaction vigne/ Botrytis cinerea a permis de mettre en évidence la régulation de différents gènes de la plante. Parmi ceux-ci la séquence complète d’un gène (V.v24.1) codant pour une protéine F-box à motif kelch a été caractérisée. Les protéines F-box sont ubiquitaires chez les Eucaryotes, un bon nombre d’entre elles interviennent comme composant du complexe SCF (Skip, cullin, F-box) impliqué dans le processus de protéolyse médié par le système ubiquitine/protéasome 26S. Nous avons dans un premier temps étudié la régulation du gène V.v 24.1 ainsi que celle de son orthologue A.t 24.1,  chez A. thaliana, dans les mécanismes de défense. Les deux F-box, bien que très proches d’un point de vue structural, ne semblent pas être régulées par les mêmes stress biotiques et abiotiques. La F-box de vigne est régulée suite à un stress UV, à l’attaque par B. cinerea, agent nécrotrophe, et par Pseudomonas syringae pv pisi, agent biotrophe, ou suite à un traitement par le methyl-jasmonate (MeJA) et l’acide salicylique (AS). L’orthologue chez A. thaliana est régulé par l’attaque par des pathogènes biotrophes, tels que P. syringae pv tomato (interactions compatible et incompatible) ainsi que par le traitement à l’AS ; alors que les UV, l’attaque par B. cinerea et le traitement par le MeJA semblent n’avoir aucun effet sur son expression. Les deux protéines F-box pourraient jouer un rôle dans la régulation des mécanismes de défense de la plante, mais à des niveaux différents.

Dans un second temps une étude fonctionnelle basée sur l’étude de mutant d’A. thaliana et l’expression transitoire chez le tabac de la F-box de vigne permettra de préciser son importance dans les mécanismes de défense et, à long terme de démontrer son rôle éventuel dans le processus d’ubiquitination en caractérisant les protéines cibles interagissant avec la F-box et son implication potentielle dans le complexe SCF.



Poster n° 16


Mécanismes moléculaires de la résistance du caféier à l'agent de la rouille orangée: caractérisation du gène CaWRKY1

A.-S. Petitot, D. Ganesh, A.-C. Lecouls, D. Fernandez

IRD, UMR 1097 Diversité et Génome des Plantes Cultivées, Equipe Résistance des Plantes, 911, avenue Agropolis, BP 64501, 34394 Montpellier Cedex 5


L'interaction entre le caféier (Coffea sp. L.) et le champignon biotrophe Hemileia vastatrix, agent de la rouille orangée, est basée sur une relation gène - à - gène. Neuf gènes de résistance ont été identifés chez l'espèce allotetraploïde Coffea arabica et les autres espèces de caféier diploïdes apparentées. En situation d'incompatibilité, une réaction de type hypersensible peut être visualisée dès 24 h après l'inoculation du champignon. Pour identifier et caractériser les gènes associés à la résistance de C. arabica, des banques soustractives ont été réalisées 12, 24 et 48 h post-inoculation et un catalogue d'environ 800 EST a été établi.

Parmi les gènes candidats sélectionnés par tri differentiel des ESTs, un clone présentant de fortes similarités avec un facteur de transcription de type WRKY a été identifié. Le clonage du gène correspondant a permis d'isoler deux séquences dénommées CaWRKY1a et CaWRKY1b. Les protéines putatives CaWRKY1a (573 aa) et CaWRKY1b (572 aa) possèdent les caractéristiques structurales (domaine WRKY, Leucine zipper, signal de localisation nucléaire) des facteurs de transcription WRKY et se classent dans le groupe II-b des facteurs WRKY d'Arabidopsis thaliana. Les séquences promotrices possèdent 76% d'homologies et contiennent plusieurs boites W suggérant une régulation de ces gènes par d'autres facteurs de transcription de type WRKY. Enfin, une analyse phylogénétique du gène dans le genre Coffea suggère que chacune des deux copies appartiendrait à un des deux anciens sous-génomes diploïdes de C. arabica  et qu'il s'agirait de deux copies homéologues.

Les niveaux de transcrits des deux gènes ont été quantifiés par qPCR Les résultats ont montré une induction précoce des 2 gènes, dès 9 h après inoculation par H. vastatrix, et une surexpression dans l'interaction incompatible par rapport à l'interaction compatible. Les 2 gènes sont aussi rapidement induits par blessure et par l'acide salicylique. Ils sont régulés de manière similaire en conditions de stress biotique et abiotique ce qui semble exclure l’hypothèse d’une divergence fonctionnelle des deux copies.



Poster n° 17


Impact de produits éliciteurs sur le métabolisme des oxylipines lors d'une interaction compatible blé/Blumeria graminis f.sp. tritici

D. Renard (1),
P. Reignault (1), F. Laruelle (1), E. Nowack (2), R. Durand (1)

(1) Laboratoire "Mycologie~Phytopathologie~Environnement", Université du Littoral Côte d'Opale, B.P. 699, 62228 Calais Cedex
(2) Laboratoire d'Informatique et de la Statistiques, Institut Supérieur d'Agriculture de Lille, 48, boulevard Vauban, 59046 Lille Cedex


Plusieurs processus enzymatiques et cytologiques, menant notamment à l'augmentation du métabolisme des formes activées de l’oxygène, sont étudiés au sein de notre laboratoire dans le cadre de l’élicitation des réactions de défenses par différents éliciteurs chez le blé. Selon les expériences, la plante est confrontée ou non à l'infection par Blumeria graminis f.sp. tritici. La présente étude est principalement axée sur les mécanismes mis en jeu d’un point de vue lipidique, suite à la seule application de quatre substances élicitrices distinctes (Iodus 40Ò, MilsanaÒ, salicylyl heptanoate ou SH, et tréhalose), ou bien suite à la combinaison entre traitements et inoculation par l'agent pathogène (Randoux et al, 2006).

Nous avons tout d'abord dressé un bilan global, quantitatif et qualitatif, de l'impact sur les profils d'acides gras de la plante des traitements et/ou des inoculations. Par ailleurs, ces différents traitements et/ou inoculations entraînent chez la plante un stress membranaire. En effet, les éliciteurs et l’agent pathogène engendrent une bio-détérioration des membranes et l’action immédiate d’une lipase. Cette enzyme permet la libération d’acides gras (acides linoléique et linolénique) utilisés comme substrats préférentiels pour l'activité lipoxygénase. Nous avons montré que la LOX est essentiellement activée au cours d’un traitement par le SH et catalyse la peroxydation des lipides. La méthode TBARS qui permet de quantifier la production de malonaldéhyde (MDA) qui résulte de la peroxydation lipidique, montre que le SH entraîne une augmentation de la peroxydation des lipides à partir du quatrième jour après traitement. L’effet du MilsanaÒ et du Iodus 40Ò est en revanche visualisé plus précocement, sous forme d’une diminution de la concentration en MDA.

Les hydroperoxydes lipidiques obtenus au cours de la peroxydation peuvent être convertis en oxylipines qui correspondent à une étape transitoire du métabolisme lipidique. Ces oxylipines empruntent en général l’une de ces deux voies : celle des keto-diènes ou celle des allènes oxides, qui correspond à la voie de synthèse de l’acide jasmonique. Une quantification de ce dernier par chromatographie en phase gazeuse permettra de montrer l’impact des traitements et/ou de l’inoculation sur la formation de l’acide jasmonique au cours de l'interaction.

Référence :

Randoux B., Renard, D., Reignault, Ph, Sanssené, J., Nowack, E., Courtois, J., Durand, R. Activités élicitrice et protectrice de substances d'origine naturelle lors d'une interaction compatible blé/Blumeria graminis f.sp. tritici. Sixièmes rencontres de Phytopathologie/Mycologie-Journées Jean Chevaugeon 2006, Aussois.



Poster n° 18


Caractérisation du pathosystème Medicago truncatulaFusarium oxysporum f.sp. medicaginis

M. Rickauer

Laboratoire Biotechnologie et Amélioration des Plantes, INP-ENSAT, Pôle de Biotechnologie Végétale, 18 chemin de Borde-rouge, BP 32607 Auzeville, 31326 Castanet-Tolosan


La légumineuse modèle Medicago truncatula est capable d'établir au niveau de ses racines des relations aussi bien symbiotiques (Sinorhizobium meliloti, mycorhizes) que pathogènes. Ainsi cette plante-hôte permet de réaliser des études comparatives afin de comprendre les mécanismes qui régulent localement l'acceptation d'un micro-organisme symbiotique tout en gardant la capacité de la plante à se défendre contre des micro-organismes pathogènes.

Une première étape pour ces études constitue la caractérisation d'un pathosystème racinaire. Fusarium oxysporum est un champignon du sol infectant de nombreuses espèces végétales,chez lesquelles il cause la maladie du flétrissement vasculaire. La forma spécialis "medicaginis" est connue d'infecter la luzerne, M. sativa. Nous avons étudié plusieurs souches de Fusarium oxysporum f.sp. medicaginis (Fom) isolées de Luzerne ; toutes étaient capables d'infecter M. truncatula, et toutes les lignées de la plante étudiées se sont avérées sensibles au champignon.

Afin de suivre les étapes de la colonisation de la racine, un des isolats de Fom a été transformé par le gène marqueur gfp à l'aide d'Agrobacterium tumefaciens.

Les premiers résultats de ces études seront présentés.



Poster n° 19


Stimulation des défenses naturelles des plantes par l’éliciteur StifeniaÒ

C. Siddi (1), P. Marmey (2), J.-P. Renou (4), J.-C. Baccou (1), M. Nicole (2), C. Martinez ( 3)

(1) UMR IR2B, Université Montpellier II, 34095 Montpellier
(2) IRD UMR DGPC, Unité "Résistance des plantes", 34394 Montpellier
(3) Société Occitane de Fabrication et Technologies (SOFT), 11210 Port La Nouvelle
(4) URGV, UMR INRA 1165 - CNRS 8114 - UEVE, 91057 Evry

L’Université, en collaboration avec la société SOFT a mis au point  StifeniaÒ, un nouvel éliciteur issu de graines de légumineuses, qui répond aux préoccupations environnementales actuelles.

Son efficacité est testée sur plusieurs modèles plantes/ agents pathogènes, choisis pour la diversité du mode d’action de ces derniers (infections foliaires ou racinaires) : Cucumis melo/ Sphaerotheca fuliginea, Cucumis melo/ Fusarium oxysporum sp. melonis, Cucumis melo/ Pseudomonas syringae pv. aptata, Gossypium hirsutum / Xanthomonas campestris pv. malvacearum, Arabidopsis thaliana/ Golovinomyces cichoracearum, Arabidopsis thaliana/ Fusarium oxysporum sp. Rafani, Arabidopsis thaliana/ Pseudomonas syringae pv. tomato (étude encore en cours suivant les modèles). Nos résultats montrent que la pulvérisation foliaire de FEN560 protège les plantes contre l’apparition des symptômes de la maladie, pendant un mois environ. Le traitement par pulvérisation de l’éliciteur induit le phénomène de priming, après infection par l’agent pathogène. En effet, chez les plants prétraités par StifeniaÒ, on observe une induction plus rapide et plus intense des mécanismes de défense (activité peroxydase et production d’acide salicylique) au site d’infection de l’agent pathogène.

L’étude des gènes induits suite à l’utilisation de StifeniaÒ sur le modèle Arabidopsis thaliana/ Fusarium oxysporum sp. Rafani est en cours, grâce à l’utilisation de puce à ADN Catma, en partenariat avec l’INRA d’Evry. En parallèle, nous essayons de mettre en évidence l’induction d’une mort cellulaire programmée, suite à l’infection par l’agent pathogène des plants prétraités par StifeniaÒ. Une purification du(ou des ) principe(s) actif(s) de StifeniaÒ, est aussi en cours de réalisation, dans le but d’étudier par la suite la reconnaissance de cette molécule par la plante.



Poster n° 20


Effect of Truffle Volatiles on the Development of A. thaliana

R. Splivallo, S. Bossi, M. Maffei, P. Bonfante

Department of Plant Biology, University of Torino, ITALIE


Plant/truffle interactions are currently analyzed by using molecular methods to investigate the changes taking place in both organisms at the level of gene and protein differential expression. We decided to study this interaction by investigating what effect volatile organic compounds (VOCs) emitted by truffles could produce on the model plant Arabidopsis thaliana. Truffles, ascomycetes fungi, were chosen on three grounds (i) their hypogeous fruitbodies release a blend of VOCs in the rhizosphere that can interact with plants roots; (ii) a large body of knowledge already exists about those VOCs in literature; (iii) many VOCs emitted by truffles are also common to most fungi and are therefore of major ecological importance.

The aim of this work was double:(i) to test the effect of the VOCs (blend from fruitbodies and single synthetic VOCs) on A. thaliana using a compartmented Petri system where the fungus and plants were interacting only through VOCs; (ii) to identify the bioactive VOCs (using head space stir bar sorptive extraction coupled to GC/MS). The major VOCs from three truffle species (Tuber borchii, T melanosporum, T.indicum) included 2-methyl-1-propanol, 2-methyl-1-butanol, 3-methyl-1-butanol, 1-octen-3-ol, 3-ocatnone, phenylethyl alcohol and 1-hexanol.

The VOCs blend released directly from the fruitbodies induced strong root shortening for all three truffle species (up to 75% versus control), and in the case of two species (T.melanosporum and T.borchii) germination inhibition and a strong bleaching (white hypocotyls and cotyledons) for the germinated seedlings. The effects of the synthetic single VOCs on A. thaliana are currently under investigation to understand which one is/are responsible of the effects described above with the fruitbodies.

Further work shall be done by testing VOCs mixtures (the ones listed above) to highlight their synergic/antagonistic effect, and get a better feel for what their threshold of action could be in nature.



Poster n° 21


L’histidine kinase BOS1 est impliquée dans le développement, l’osmorégulation, la résistance aux fongicides et la virulence chez Botrytis cinerea

M. Viaud (3), W. Liu (1), J. S. Polepalli (2), L. Legendre (2), P. Leroux (1), S. Fillinger (1)

(1) UPMC, INRA Versailles, Route de Saint-Cyr, 78026 Versailles
(2) Centre for Horticulture and Plant Sciences, University of Western Sydney, Locked bag 1797, Penrith South DC, NSW 1797, AUSTRALIE
(3) PMDV, INRA Versailles, Route de Saint-Cyr, 78026 Versailles


Le champignon phytopathogène Botrytis cinerea, l’agent de la pourriture grise, cause d’importantes pertes sur plus de 200 espèces végétales. L’utilisation de fongicides reste le principal moyen de lutte efficace contre cette maladie. Cependant, l’utilisation d’anti-botrytis de type dicarboximides a entraîné l’apparition de résistance (ImiR) au champ. Des isolants ImiR du laboratoire présentent en plus une résistance aux phénylpyrroles et une osmosensibilité, mais ils n’ont jamais été détectés dans la nature. La plupart des mutations ImiR affectent l’histidine kinase BOS1.

Afin de mieux comprendre le rôle de ce gène, nous avons entrepris une étude détaillée des mutants d’inactivation (Δbos1). Ceux-ci ne sporulent pas in vitro, mais la formation des conidiophores n’est pas affectée. Ceci suggère que BOS1 n’a pas d’effet sur l’initiation de la conidiation, mais qu’il est nécessaire pour la différentiation. Les mutants Δbos1 sont sensibles au stress osmotique, résistants aux trois types des fongicides (dicarboximides, phenylpyrroles et hydrocarbures aromatiques) et cross résistants au ménadione. Mais ils ne sont pas sensibles à d’autres conditions de stress. De plus, une forte réduction du pouvoir pathogène a été observée chez ces mutants Δbos1 par rapport à la souche parentale. L’analyse par microscopie a démontré que la délétion du gène bos1 n’affecte pas la capacité de pénétration. L’ensemble de nos résultats a mis en évidence l’implication de l’histidine kinase BOS1 dans la résistance à certains fongicides, la réponse au stress osmotique, le développement asexuel et le processus infectieux de B. cinerea. D’ailleurs nous avons démontré que les fongicides induisent l’accumulation du glycérol intracellulaire chez B. cinerea via la cascade de signalisation BOS1.

En parallèle, le gène sak1 a été cloné et inactivé au laboratoire de P. Tudzynski à l’Université  de Münster en Allemagne. Etant donné que le gène sak1 code une MAP kinase orthologue à celles impliquées dans la transduction du signal osmotique et que les mutants ∆sak1 présentent une hypersensibilité au stress osmotique, une absence de la sporulation et de la virulence, nous supposons que la MAP kinase Sak1 et l’histidine kinase BOS1 agissent dans la même voie de cascade de signalisation. De plus, le test de la croissance montre que les mutants ∆sak1 sont plus sensibles aux fongicides que la souche sauvage suggérant que l’histidine kinase BOS1 agit comme inhibiteur de la MAP kinase Sak1. Le double mutant est en cours de construction pour un test d’épistasie afin de mettre en évidence l’interaction entre Sak1 et BOS1.



Poster n° 22


ESCA disease affects photosynthesis in grapevine generating stomatal closure and alteration of the photosynthetic apparatus

A.-N. Petit
(1), N. Vaillant (1), M. Boulay (2), C. Clément (1), F. Fontaine (1)

(1) Laboratoire de Stress, Défenses et Reproduction des Plantes, URVVC UPRES EA 2069, Université de Reims Champagne-Ardenne, UFR Sciences, Moulin de la Housse, BP 1039, 51687 Reims Cedex 2
(2) Moët et Chandon Recherche, 6, rue Croix de Bussy, 51200 Epernay


To further understand the development of wood decay disease in grapevine, its physiological impact on plants grown in vineyard was characterized, focusing mainly on photosynthesis. For this purpose, photosynthetic apparatus state was evaluated in leaves differentially affected by symptoms and wood carbohydrates stored in annual canes were assayed.

Foliar symptoms were characterized by both stomatal closure and alteration of the photosynthetic apparatus, as revealed by (i) a decrease in CO2 assimilation, transpiration and a Ci significant increase (ii) a strong drop in both Fm’ and ФPSII and (iii) a reduction of total chlorophyll but a stable carotenoid content. On symptomatic canes, all these parameters were more affected on leaves with symptoms rather than without symptoms, suggesting a gradation in photosynthesis disruptions in the plant according to the degree of plant affection. Besides, canes of symptomatic plants presented a reduction of carbohydrate reserves during the winter rest, whether they exhibit symptoms or not. The year after, the lower pool of reserves conducts to a significant decrease in flower and fruit formation, as well as a global loss in plant vigour.

Despite the absence of fungi in symptomatic leaves and annual canes, esca affected deeply grapevine physiology, suggesting that related fungi growing in the perennial wood generate symptoms in leaves through a signal (toxin ?) which is transported from the wood to the annual organs.



Poster n° 23


Purification et analyse de structure de la Cassiicoline, déterminant majeur de la pathogénicité de Corynespora cassiicola chez l’hévéa

C. Sanier (1), M.-P. Duviau (2), F. Breton (3), P. Barthe (4), J. Poncet (5), C. Roumestand (4), F. de Lamotte (2), V. Pujade-Renaud (1)

(1) CIRAD, UMR PIA, TA 80 / 03, Avenue Agropolis, 34398 Montpellier Cedex 5
(2) INRA, 2, place Viala, Bât 31, 34060 Montpellier Cedex 01
(3) CIRAD, PP London Sumatra Indonesia, Bah Lias Research Station, J1 Jend A Yani No 2, PO BOs 1154, Medan 20011, INDONESIE
(4) Centre de Biochimie Structurale, UMR UM1 / 5048 CNRS / 554 INSERM, Faculté de Pharmacie, BP 14491, 15, avenue Charles Flahault, 34093 Montpellier Cedex 5
(5) Institut de Génomique Fonctionnelle, 141, rue de la Cardonille, 34094 Montpellier Cedex 5


Corynespora cassiicola est un champignon phytopathogène nécrotrophe qui provoque des lésions nécrotiques sur la plupart des organes des plantes infectées. Des cas d’infection par C. cassiicola ont été décrits chez plus de 70 plantes hôtes, parmi lesquelles la tomate, le concombre, le cotton, le soja ou l’hévéa. Dans le cas de l’hévéa, la pathologie induite par C. cassiicola (CLFD, ou « Corynespora Leaf Fall Disease ») se manisfeste par des lésions aussi bien sur jeunes feuilles que sur feuilles matures, un noircissement des nervures donnant un profil typique en « arrêtes de poisson », et des défioliations massives pouvant conduire à la mort de l’arbre. La CLFD est en constante progression dans toutes les zones de production. Une étape importante pour la compréhension des mécanismes d’infection de l’hévéa par C. cassiicola fut la mise en évidence d’un toxine, baptisée cassiicoline, présente dans le milieu de culture du champignon, et qui semble être un facteur de pathogénicité déterminant.

Nous avons purifié un lot de cassiicoline jusqu’à homogénéité complète à partir d’un isolat de C. cassiicola agressif sur hévéa (souche CCP). Le procédé de purification comporte une étape de chromatographie en phase réverse suivie d’une étape de chromatographie par exclusion de taille, chaque étape faisant l’objet d’un biotest sur feuilles d’hévéa détachées. Des analyses par microséquençage, spectrométrie de masse et RMN nous ont permis d’établir avec précision la structure de la cassiicoline. Il s’agit d’une petite protéine glycosylée de 2885 Da qui, après analyse comparative avec les bases de données publiques de séquence et structure tridimitionnelle, ne présente aucun homologue connu. Une analyse similaire est en cours à partir d’un deuxième isolat d’origine géographique différente afin de déterminer si la variabilité des souches en terme d’agressivité peut être attribuée à des différences de structure de la toxine produite.



Poster n° 24


Caractérisation moléculaire d’un jeu de cultivars de riz pour leur résistance partielle à Magnaporthe grisea

E. Vergne (1), E. Ballini (1), J.-B. Morel (1), D. Tharreau (1), M.-H. Lebrun (2), J.-L. Nottéghem (1)

(1) INRA et CIRAD - UMR BGPI, Campus International de Baillarguet TA 41/K, 34398 Montpellier cedex 5
(2) CNRS Lyon, UMR 2847, CNRS-Bayer CropScience, 14 rue Pierre Baizet BP 9163, 69263 Lyon cedex 9

Dans le domaine de la résistance des plantes aux maladies, outre le développement d’une résistance complète de type gène pour gène, on peut observer une limitation de l’infection par la mise en place d’une résistance de niveau plus ou moins élevé que l’on appelle résistance partielle. L’étude des interactions entre une plante hôte et un agent pathogène nécessite des méthodes d’estimation fiables de la sévérité de la maladie, qu’il s’agisse de diagnostiquer une maladie ou bien de tester les différences phénotypiques entre variétés d’une même espèce, entre isolats d’un même pathogène. Actuellement, la plupart des moyens utilisées lors du diagnostic de maladies fongiques sont d’ordre visuel avec une caractérisation du type de lésion, une mesure de leur diamètre et le comptage du nombre de symptômes. Cependant ces examens sont fastidieux et ne permettent généralement pas de discriminer des niveaux de résistance légèrement différents. Le but de ce travail a été de caractériser un jeu de 30 cultivars de riz (appartenant aux sous-espèces indica et japonica) pour leur résistance partielle à l’isolat CM28 du pathogène Magnaporthe grisea. Cette résistance partielle a été évaluée par dosage de l’ADN du champignon au cours du temps, ainsi que par dosage quantitatif (Q-PCR) de l’expression de gènes du champignon à sept jours post inoculation. Ces gènes sont représentatifs de la quantité de mycélium ou de spore. Les résultats montrent tout d’abord que la quantification de l’ADN permet de suivre le développement du champignon dans les phases précoces de l’infection. Le dosage de l’ADN et de l’expression de gènes du champignon permet également de classer les cultivars en groupe de niveau de résistance partielle (élevé, moyen, faible). Par ailleurs, ces résultats laissent supposer que les cultivars au niveau de résistance partielle élevée bloquent le développement du champignon au stade de la prolifération mycélienne  plutôt qu’au stade de la sporulation.  Ce travail établit les bases d’une étude approfondie de la résistance partielle du riz à Magnaporthe grisea et de sa régulation transcriptionelle. Des analyses du transcriptome ont permis de mettre en évidence des gènes impliqués dans ce processus. L’analyse de l’expression de ces gènes sur le jeu de cultivars préalablement caractérisés pour leur résistance partielle devrait permettre d’établir une corrélation entre l’expression des gènes et le niveau de résistance partielle et ainsi améliorer notre connaissance des caractéristiques génétiques et transcriptionnelles de la résistance partielle du riz à Magnaporthe grisea.



Poster n° 25


Colzas haut oléiques résistants au sclérotinia

S. Hallier, J.-P. Didier, B. Shorrosh

CARGILL, Fort Collins, Colorado, USA


Le sclérotinia (Sclerotinia sclerotiorum) est une des principales maladies du colza (Brassica napus). Le coût élevé du traitement fongicide motive le développement de variétés presentant un bon niveau de résistance. L’influence importante des lipides dans les mécanismes de résistance étant bien connue, il était intéressant de modifier les voies lipidiques afin d’en étudier les effets sur le niveau de résistance aux maladies, en particulier sur le niveau de résistance au sclérotinia contre lequel il est si difficile de trouver un bon niveau de résistance. La variété de colza Westar a été mutée dans les gènes Fad2D et Fad2F afin d’augmenter la teneur en acide oléique, diminuant parallèlement la teneur en acide linoléique. Des tests d’inoculation sclérotinia sur feuilles détachées ont montré que ces mutants étaient significativement plus résistants par rapport à des colzas présentant une proportion d’acides gras normale. Ces résultats ont été confirmés par une complémentation fonctionnelle par transformation des mutants avec le gène Fad2D. Ils ont également été confirmés par cossupression des gènes Fad2. Nos résultats ont donc permis de mettre en évidence l’influence sur feuille de la composition en acides gras sur la résistance au sclérotinia : l’augmentation de la teneur en acide oléique en parallèle avec la diminution en acide linoléique entraine en effet un niveau de résistance significativement supérieur a celui obtenu avec une teneur en acide oléique classique. Nos études ont également montré qu’aucune variété de colzas ne présente un tel niveau de résistance sur feuille. Ces résultats apportent l’espoir de voir, dans le futur proche, l’apparition de variétés de colzas résistantes au sclérotinia.



Poster 26


Cartographie de gènes de résistance du colza; Leptosphaeria maculans

J.-P. Didier

CARGILL Specialty Canola Oils, 2540 E Drake Road, Fort Collins, CO 80521, USA


Leptosphaeria maculans est l’agent pathogène responsable de la nécrose du collet chez les Brassica spp... Cette maladie est la plus grave et la plus répandue des Brassica spp.. L’utitlisation de gènes majeurs de résistance a permis de controler cette maladie. L’utilisation extensive de ces gènes majeurs a cependant conduit à un changement rapide de la population du pathogène dans le monde : France (Rlm1), Canada (gène de Q2) et Australie (gène de B. sylvestris). La cartographie de gènes de resistance majeure et de QTLs peut permettre une introduction plus rapide des gènes de resistance et plus particulièrement des QTLs, permettant d’augmenter la durabilité des résistances utilisées au champ. Pour ce projet de cartographie, les évaluations phénotypiques ont été réalisées en conditions contrôlées avec des isolats de races charactérisées, ainsi qu’au champ, au Canada et en Australie. L’analyse des QTLs a été faite par Simple Interval Mapping SIM et Composite Interval mapping CIM par MapQTL. A un taux α=0.05 et un LOD >2.6, le gène majeur de résistance est identifié avec un R2 variant entre 30 et 50% (Manitoba, 2003 et infection avec la race PG2). Deux QTLs expliquant 10% de la variation observée ont été aussi identifiés pour la resistance commune entre le champ et le laboratoire et deux autres spécifiques du champ (8%). C’est la première fois que de la cartographie comparée de la resistance pour L. maculans a été faite entre le Canada et l’Australie et qu’une resistance commune entre la resistance au champ et la resistance sur cotyledons a été mise en évidence.  Les futurs travaux sont maintenant orientés vers l’extension de la carte génétique grace a l’utilisation de nouveaux SSR, ainsi que l’utilisation d’analogues de gènes de résistance.



Poster n° 27


La signalisation pH chez le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea

C. Bordi (2), C. Bruel (1), V. Girard (2), P. Landraud(1), M.-B. Martel (2), N. Poussereau (2), C. Rascle (2)

(1) CNRS - Bayer CropScience U.M.R. 14-20, rue Pierre Baizet,.69363 Lyon
(2) Labratoire de Biologie Cellulaire Fongique, Université Lyon I, 10, rue Dubois, 69622 Villeurbanne


Les champignons pathogènes attaquent dans leur ensemble un large spectre d'hôtes, qu'ils soient animaux, végétaux ou même fongiques. Ces organismes ont donc développé au cours de l'évolution une forte capacité d'adaptation à l'environnement qu'ils rencontrent lors de l'infection d'un hôte. Un des paramètres majeurs de tous les milieux biologiques est le pH. Au cours du processus infectieux, le pathogène est sensible au pH du milieu ambiant dans lequel il se trouve et réagit de manière à s'adapter à ces conditions.
Le champignon phytopathogène Botrytis cinerea, Ascomycète responsable de la pourriture grise sur plus de 200 plantes hôtes, se caractérise par un processus infectieux basé d'une part sur la sécrétion d'enzymes lytiques adaptées au pH rencontré et, d'autre part, sur la production d'acide oxalique au stade initial de l'infection. Nos résultats ont montré que la production de plusieurs familles d'enzymes lytiques est dépendante du pH ambiant et sous-entendent l'existence d'une voie de signalisation pH pouvant jouer un rôle central dans la pathogenèse du champignon.
Sur la base des travaux effectués chez le champignon saprophyte Aspergillus nidulans, cette voie serait composée de six protéines et régulerait la transcription de nombreux gènes « pH-dépendants » en gouvernant l'activation par protéolyse du facteur de transcription PACC. Cette voie, conservée chez les champignons, semble essentiellement réguler les gènes alcalins et peu d'informations sont disponibles sur le contrôle des gènes "acides".

Afin d'apprécier l'importance de la régulation pH sur la physiologie et sur les différentes étapes du processus infectieux de B. cinerea, nous avons choisi d'explorer l’étape initiale de la perception du signal pH et de caractériser la régulation des gènes acides.



Poster n° 28


Sclerotinia sclerotiorum et Botrytis cinerea : comparaison in vivo et in vitro de leurs processus infectieux ( production d'acide oxalique et mise en place du système protéolytique)

G. Billon-Grand, P. Reymond-Cotton, N. Poussereau

Université Lyon 1, UMR 5122 Microbiologie et Génétique, Laboratoire de Biologie Cellulaire Fongique, 10 rue Raphaël Dubois, 69622 Villeurbanne Cedex


Sclerotinia sclerotiorum et Botrytis cinerea présentent une importante homologie entre leurs séquences génétiques. De même, leurs processus infectieux apparaissent, à première vue, très similaires et, notamment, leurs équipements protéolytiques. Au cours de l'infection, ils sécrètent tous deux le même type d'enzymes protéolytiques: une sérine protéase ( pH optimal = 7,0 ), des aspartyl-protéases ( pH optimal = 4,5 et 3,0 ) et une protéase acide active à pH 2,0. Nous avons produit des anticorps polyclonaux dirigés contre chacune des protéases de S. sclerotiorum et ceux-ci croisent avec celles de Botrytis cinerea. Une étude approfondie, effectuée in vivo et in vitro, a montré de grandes différences dans la mise en place de leurs systèmes protéolytiques. Au cours de l'infection in vivo, l'invasion des tissus végétaux par S. sclerotiorum entraîne une rapide chute de pH( vraisemblablement liée à la production d'acide oxalique ) tandis que B. cinerea provoque seulement une légère chute de pH suivie d'une rapide remontée. Nous avons confirmé par Western blot que la mise en place des protéases in vivo était différente. Les résultats obtenus in vitro montrent que S. sclerotiorum acidifie de façon drastique tous les milieux de culture tandis que B. cinerea les alcalinise, sauf en présence de glucose dans le milieu inducteur. Par ailleurs, si les aspartyl-protéases et surtout l'AcP1 sont largement prépondérantes chez S. sclerotiorum, la sérine protéase est largement majoritaire chez B. cinerea. Ainsi ces deux champignons filamenteux  phytopathogènes nécrotrophes possèdent bien une panoplie similaire de protéases mais leur mise en place en est fondamentalement différente. En outre, le rôle de l'acide oxalique dans la pathogénèse de ces deux champignons nécrotrophes semblerait assez différent.