Recherche de facteurs de pathogénie chez Leptosphaeria maculans : caractérisation d’un mutant de pénétration obtenu par mutagénèse insertionnelle aléatoire

 

E. Rémy, M. Meyer, F. Blaise, M.-H. Balesdent, J.-Paul Narcy, J. Roux, M. Chabirand, L. Coudard, T. Rouxel

 

Unité PMDV, INRA Centre de Versailles, Route de Saint-Cyr, 78026 Versailles Cedex

 

 

Leptosphaeria maculans, agent de la nécrose du collet des crucifères, est un pathogène majeur du colza. C’est un champignon exemplaire des stratégies d’infection des Dothidéomycètes, l’une des classes d’ascomycètes comportant le plus d’espèces de phytopathogènes fongiques aériens. Une collection de 3000 transformants obtenue par agrotransformation a récemment été générée et caractérisée au laboratoire. Ici, nous décrivons la caractérisation phénotypique et fonctionnelle d’un mutant typique de pénétration. Ce mutant, également affecté dans sa croissance in vitro, induit sur feuille de colza une réaction d’hypersensibilité et est incapable de coloniser la tige. Une analyse de génétique formelle menée sur quarante sept descendants démontre l’étiquetage du mutant, c’est-à-dire la co-ségrégation du marqueur de sélection avec le phénotype observé. Le séquençage de la région génomique où l’insertion de l’ADN-T de l’agrobactérie a eu lieu a permis de la localiser dans la région promotrice de deux gènes organisés en tête-bêche et organisés de façon identique chez l’espèce proche, Stagonospora nodorum. L’insertion s’accompagne d’une délétion de 100 pb de la région promotrice. Ces deux gènes, annotés précisément de façon expérimentale, codent pour des protéines de fonction(s) biologique(s) inconnue(s), mais présentant des domaines fonctionnels fortement conservés. Des expériences de complémentation fonctionnelle du mutant, par apport d’une copie sauvage de chacun des deux gènes séparément ou ensemble, ont prouvé qu’un seul des deux était effectivement responsable à la fois du défaut de pathogénie et de croissance. D’autre part, l’expression de ces deux gènes cibles a été vérifiée par RT-PCR classique dans différentes conditions in vitro, et également au cours de l’infection in planta. De façon étrange, on observe le maintien de leur expression chez le mutant. A présent, des études plus fines par RT-PCR quantitatives sont en cours, afin d’évaluer les niveaux d’expression des deux gènes chez le mutant, par rapport à la souche sauvage. Enfin, une analyse précise des transcrits mutants visera à identifier des modifications au niveau de la taille ou de la séquence du transcrit pour tenter d’expliquer les défauts phénotypiques observés.