J.-P. Combier, D. Melayah, C. Raffier, R. Marmeisse et G. Gay
Université Claude-Bernard Lyon 1 - UMR CNRS 5557 Ecologie Microbienne, Bât. A. Lwoff, 43 Bd du 11 Novembre 1918, 69622 Villeurbanne cedex

Les mécanismes moléculaires impliqués dans l'établissement de la symbiose ectomycorhizienne sont encore mal connus. Différents programmes d'EST ont permis d'identifier de nombreux gènes exprimés dans les structures symbiotiques, le criblage différentiel de banques d'ADNc ainsi que l'utilisation de puces à ADN ont permis d'identifier des gènes différentiellement exprimés dans les mycorhizes. Par contre aucun gène, qu'il soit d'origine fongique ou végétale, indispensable à la formation ou au fonctionnement de la symbiose n'a pour l'instant été identifié.
Dans le but d'identifier des gènes fongiques nécessaires à l'établissement de la symbiose ectomycorhizienne, nous avons entrepris un programme de mutagenèse insertionnelle en utilisant Hebeloma cylindrosporum comme modèle. L'objectif est de sélectionner des mutants non mycorhiziens et d'identifier ensuite les gènes inactivés.
H. cylindrosporum est un des rares champignons ectomycorhizien pouvant être transformé par insertion de plasmide. Nous avons tout d'abord généré une collection de 2000 transformants en utilisant cette méthode. L'étude de l'activité mycorhizienne de ces transformants lorsqu'ils sont cultivés en présence de Pinus pinaster, a permis d'identifier 22 transformants très faiblement mycorhiziens et 29 transformants non mycorhiziens (myc-). L'analyse par microscopie photonique et électronique de certains de ces mutants suggère qu'ils sont bloqués à des étapes différentes du processus symbiotique. Dans la mesure où il est possible de faire fructifier H. cylindrosporum au laboratoire, nous avons entrepris de déterminer l'origine du phénotype myc- des transformants en étudiant la co-ségrégation dans leur descendance du phénotype non mycorhizien avec les insertions plasmidiques qu'ils contiennent. Pour l'instant, trois descendances ont été analysées et aucune co-ségrégation n'a pu être mise en évidence entre le phénotype myc- des transformants et une insertion particulière. Ceci indique que la ou les mutations à l'origine du phénotype myc- ne sont pas "tagguées" et les gènes correspondants seront de ce fait très difficiles à identifier. Face à ce problème, et sachant que la méthode de transformation utilisée génère souvent des insertions multiples, nous avons développé une nouvelle méthode permettant de transformer Hebeloma cylindrosporum à l'aide d'Agrobacterium tumefaciens. Cette méthode nous a permis de générer une collection d'environ 2000 transformants. Un premier criblage a permis d'identifier 21 transformants affectés dans leur pouvoir symbiotique. Nous nous sommes focalisés sur l'étude génétique et moléculaires de 2 d'entre eux en vue d'identifier les gènes inactivés.