Analyse fonctionnelle de clk1 et de clta1, gènes impliqués dans le pouvoir pathogène de Colletotrichum lindemuthianum

E. Bard, R. Laugé et T. Langin
Laboratoire de Phytopathologie Moléculaire, Institut de Biotechnologie des Plantes, 91405 Orsay cedex

C. lindemuthianum, champignon ascomycète, est responsable de l'anthracnose du haricot commun. Le champignon attaque toutes les parties aériennes de la plante et provoque une nécrose des tissus infectés en fin de cycle. L'infection commence par une phase de biotrophie puis se poursuit par une phase de nécrotrophie. Deux mutants non pathogènes ont été obtenus au laboratoire par mutagénèse insertionnelle aléatoire. Le premier mutant, disrupté dans le gène clk1, développe des appressoria matures mais non fonctionnels : il ne peut donc pas pénétrer la surface foliaire. clk1 code pour une sérine thréonine kinase et est l'orthologue d'apg1, impliqué chez la levure dans le contrôle de l'autophagie. Ce phénomène, induit en conditions de carences nutritionnelles, permet de recycler dans la vacuole des nucléotides, des acides aminés venant de la dégradation d'organites cellulaires via la formation d'autophagosomes. Des homologues de clk1 ont été recherchés chez d'autres champignons phytopathogènes. Par ailleurs, aut7 chez la levure, induit en conditions de carences nutritionnelles, est un marqueur de la formation des autophagosomes. L'orthologue d'aut7 chez C. lindemuthianum et chez ces autres champignons phytopathogènes ont également été clonés. Des RT-PCR sur des cinétiques d'infection du pathosystème haricot commun / C. lindemuthianum ont montré une induction transitoire de l'expression de l'orthologue d'aut7 à 18 heures (développement de l'appressorium). Ceci est un argument supplémentaire en faveur d'un phénomène autophagique induit lors du développement appressorial. Des cinétiques d'infection utilisant d'autres pathosystèmes sont en cours. Des tests in vitro en conditions de carence azotée ayant pour objectif de montrer l'induction de l'expression de l'orthologue d'aut7 en condition d'induction de l'autophagie ont été réalisés. Avec ces démarches moléculaires, l'hypothèse pré-citée sera ou non validée, en cas de validation il restera à mettre en évidence cytologiquement cette autophagie appressoriale. Le deuxième mutant, disrupté dans le gène clta1, est bloqué lors de la transition biotrophie-nécrotrophie. CLTA1 est homologue aux activateurs transcriptionnels de type Gal4, spécifiques des champignons. Ils sont impliqués dans de nombreux phénomènes cellulaires. Ces activateurs sont caractérisés par un doigt de zinc binucléaire à six cystéines en N-terminal, un domaine Middle Homology Region (MHR) et un domaine d'activation en C-terminal. La production de la protéine entière, d'une partie contenant le doigt de zinc + le MHR et du doigt de zinc seul sont en cours. Cela permettra de tester d'une part les propriétés d'homodimérisation, en effet les activateurs de type Gal4 fonctionnent généralement en formant des homodimères et d'autre part de tester la fixation à l'ADN sur des séquences prédéfinies, la séquence de fixation de ce type d'activateurs transcriptionnels étant la suivante : CGGXnCCG. Par ailleurs, une activation transitoire de clta1 lors de la phase de biotrophie a été observée. Des vecteurs sont en cours de construction pour observer la GFP soumise au contrôle du promoteur entier et tronqué de clta1 lors d'une cinétique d'infection et pour avoir une expression dérégulée de clta1. Ceci permettra respectivement de déterminer la séquence du promoteur essentielle à la régulation de l'expression de clta1 et de rechercher par soustraction les cibles primaires et secondaires de clta1.










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