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Analyse fonctionnelle de clk1 et de clta1, gènes impliqués
dans le pouvoir pathogène de Colletotrichum lindemuthianum
E. Bard, R. Laugé et T. Langin
Laboratoire de Phytopathologie Moléculaire, Institut de Biotechnologie
des Plantes, 91405 Orsay cedex
C. lindemuthianum, champignon ascomycète, est responsable de l'anthracnose
du haricot commun. Le champignon attaque toutes les parties aériennes
de la plante et provoque une nécrose des tissus infectés
en fin de cycle. L'infection commence par une phase de biotrophie puis
se poursuit par une phase de nécrotrophie. Deux mutants non pathogènes
ont été obtenus au laboratoire par mutagénèse
insertionnelle aléatoire. Le premier mutant, disrupté dans
le gène clk1, développe des appressoria matures mais non
fonctionnels : il ne peut donc pas pénétrer la surface foliaire.
clk1 code pour une sérine thréonine kinase et est l'orthologue
d'apg1, impliqué chez la levure dans le contrôle de l'autophagie.
Ce phénomène, induit en conditions de carences nutritionnelles,
permet de recycler dans la vacuole des nucléotides, des acides
aminés venant de la dégradation d'organites cellulaires
via la formation d'autophagosomes. Des homologues de clk1 ont été
recherchés chez d'autres champignons phytopathogènes. Par
ailleurs, aut7 chez la levure, induit en conditions de carences nutritionnelles,
est un marqueur de la formation des autophagosomes. L'orthologue d'aut7
chez C. lindemuthianum et chez ces autres champignons phytopathogènes
ont également été clonés. Des RT-PCR sur des
cinétiques d'infection du pathosystème haricot commun /
C. lindemuthianum ont montré une induction transitoire de l'expression
de l'orthologue d'aut7 à 18 heures (développement de l'appressorium).
Ceci est un argument supplémentaire en faveur d'un phénomène
autophagique induit lors du développement appressorial. Des cinétiques
d'infection utilisant d'autres pathosystèmes sont en cours. Des
tests in vitro en conditions de carence azotée ayant pour objectif
de montrer l'induction de l'expression de l'orthologue d'aut7 en condition
d'induction de l'autophagie ont été réalisés.
Avec ces démarches moléculaires, l'hypothèse pré-citée
sera ou non validée, en cas de validation il restera à mettre
en évidence cytologiquement cette autophagie appressoriale. Le
deuxième mutant, disrupté dans le gène clta1, est
bloqué lors de la transition biotrophie-nécrotrophie. CLTA1
est homologue aux activateurs transcriptionnels de type Gal4, spécifiques
des champignons. Ils sont impliqués dans de nombreux phénomènes
cellulaires. Ces activateurs sont caractérisés par un doigt
de zinc binucléaire à six cystéines en N-terminal,
un domaine Middle Homology Region (MHR) et un domaine d'activation en
C-terminal. La production de la protéine entière, d'une
partie contenant le doigt de zinc + le MHR et du doigt de zinc seul sont
en cours. Cela permettra de tester d'une part les propriétés
d'homodimérisation, en effet les activateurs de type Gal4 fonctionnent
généralement en formant des homodimères et d'autre
part de tester la fixation à l'ADN sur des séquences prédéfinies,
la séquence de fixation de ce type d'activateurs transcriptionnels
étant la suivante : CGGXnCCG. Par ailleurs, une activation transitoire
de clta1 lors de la phase de biotrophie a été observée.
Des vecteurs sont en cours de construction pour observer la GFP soumise
au contrôle du promoteur entier et tronqué de clta1 lors
d'une cinétique d'infection et pour avoir une expression dérégulée
de clta1. Ceci permettra respectivement de déterminer la séquence
du promoteur essentielle à la régulation de l'expression
de clta1 et de rechercher par soustraction les cibles primaires et secondaires
de clta1.
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