Thème : Biologie Génétique des Populations

Poster n° 1

Caractérisation moléculaire d'isolats d'Alternaria brassicicola résistants aux imides cycliques et aux phénylpyrroles

H. Avenot, P. Simoneau, N. Bataillé-Simoneau
UMR PaVé, Faculté des Sciences, 2 Bd Lavoisier, 49045 Angers cedex

Des isolats d'Alternaria brassicicola, l'un des agents de la maladie du black spot des crucifères, provenant de semences de radis et présentant un haut niveau de résistance vis-à-vis des fongicides appartenant aux classes des imides cycliques et phenylpyrroles, ont été identifiés. La résistance de ces souches de terrain s'exprime à différents niveaux : germination des spores, élongation des tubes germinatifs et croissance hyphale. Des tests sur milieu hypertonique (4% NaCl) ont montré par ailleurs que les souches résistantes aux fongicides sont légèrement plus osmosensibles que les souches sensibles.
Plusieurs études récentes sur des mutants de laboratoire de différentes espèces fongiques suggèrent qu'il y aurait un lien entre la résistance croisée aux imides cycliques et aux phenylpyrroles, la sensibilité au stress osmotique et certaines protéines de type histidine-kinases.
Pour comprendre la base moléculaire de la résistance à ces fongicides chez A. brassicicola, nous avons, en utilisant une stratégie PCR avec des oligonucléotides dégénérés puis par PCR walking, cloné un gène, nommé AbraHK1, à partir d'une souche sauvage d'A. brassicicola. Le gène AbraHK1 montre de fortes homologies avec le gène os-1 de Neurospora crassa, qui code pour une protéine histidine kinase osmosenseur intervenant dans la réponse de la cellule aux changements de l'osmolarité du milieu extérieur. AbraHK1 possède un domaine contenant 6 unités répétées de 90 acides aminés en partie N-terminale, un domaine histidine kinase et un régulateur de réponse en partie C-terminale.
Pour vérifier si la présence de mutation dans la séquence du gène AbraHK1 pouvait être associée à une sensibilité différentielle aux fongicides, différents couples d'amorces, complémentaires de différentes régions de ce gène ont été utilisés pour amplifier ces séquences. L'analyse comparative des séquences des produits PCR obtenus après amplification à partir de 2 individus sensibles et 2 résistants a révélé l'existence de mutations ponctuelles. Pour l'une des souches résistantes cette mutation non sens située dans la partie C-terminale du domaine kinase (au niveau du codon 998) a été détectée. Pour l'autre souche résistante étudiée, la mutation se situe au niveau de la boîte H du domaine kinase (codon 753) et se traduit par l'incorporation d'un résidu lysine à la place de l'acide aspartique La comparaison de ces résultats avec les données de la littérature nous conduit à émettre l'hypothèse que ces mutations pourraient expliquer le phénotype résistant de certaines souches testées.

Poster N° 2

Développement de marqueurs microsatellites chez Melampsora larici-populina

B. Barrès (1), C. Dutech (2), A. Andrieux (1), J. Pinon (1), P. Frey (1)
(1) INRA Nancy, UR 1139, Pathologie Forestière, 54280 Champenoux
(2) INRA Bordeaux, UMR BIOGECO, Domaine de la Grande Ferrade, BP 81, 33883 Villenave d'Ornon

La rouille foliaire, causée par Melampsora larici-populina, est actuellement la maladie la plus préoccupante pour la populiculture européenne. En effet, la plantation sur de grandes superficies d'un très faible nombre de cultivars à résistance race-spécifique a conduit à une adaptation très rapide des populations de M. larici-populina par contournements successifs des gènes de résistance déployés. La structure génétique des populations de M. larici-populina a déjà été étudiée à l'aide de marqueurs sélectionnés (facteurs de virulence) et de marqueurs neutres dominants (RAPD). Le stade urédien de M. larici-populina, qui correspond à la phase épidémique sur peuplier, étant dicaryotique, l'utilisation de marqueurs codominants pour l'analyse génétique de ces populations s'avère plus pertinente. C'est pourquoi, nous avons entrepris le développement de marqueurs microsatellites chez ce champignon. Des banques d'ADN enrichies en motifs di-nucléotidiques ont été obtenues par deux techniques : hybridation sur membranes et sur billes magnétiques. Après clonage et séquençage, nous avons défini des couples d'amorces spécifiques des loci microsatellites. Le polymorphisme de ces loci a été testé sur un panel hiérarchisé (mondial, régional, local) de souches de M. larici-populina. L'utilisation de ces marqueurs microsatellites nous permettra d'étudier la structure génétique de M. larici-populina, en particulier le rôle de la reproduction sexuée, les échanges entre compartiments cultivés et sauvages, et la migration intercontinentale.

Poster N° 3

Biodiversité de l'Oïdium de la vigne : rôle d'un rétro transposon discriminant les groupes génétiques d'Uncinula necator

J. Bouscaut et M.-F. Corio-Costet
I.N.R.A de Bordeaux E.N.I.T.A-B, U.M.R. Santé Végétale, Domaine de la grande Ferrade, 71 rue Edouard Bourleaux B.P. 81, 33883 Villenave d'ornon

L'Oïdïum de la vigne, Uncinula necator (Schw.) Burr., est un champignon ascomycète haploïde, hétérothallique, ectoparasite, biotrophe obligatoire de la vigne (Vitis vinifera L.).Cet agent pathogène est la cause des plus importantes conséquences économiques dans le monde, pouvant conduire à la perte de la totalité de la récolte. ;Peu de données concernant la structure des populations d'U. necator sont disponibles, cependant, la connaissance de cette structure semble être une condition nécessaire dans l'optique du développement de méthodes de lutte contre cette maladie d'une manière raisonnée. Récemment, il a été mis en évidence l'existence de deux écotypes d'Oïdium de la vigne, lesquels apparaissent être en relation avec leur mode de conservation hivernal in natura (un mode de conservation sexuée ou asexuée). L'écotype A, prélevé généralement à partir de symptômes appelés " drapeaux ", est associé à un mode de conservation asexué sous l'aspect d'un mycélium latent dans les bourgeons dormants (présentant seulement un signe sexuel retrouvé en France). Alors que les souches appartenant à l'écotype B, dont les deux signes sexuels sont retrouvés dans le vignoble français, seraient liées à un mode de conservation sexué durant l'hiver, observable par la présence de cléistothéces résultant de la rencontre de deux mycéliums sexuellement compatibles. Nous avons cherché à comprendre le rôle de la biodiversité existante chez l'Oïdium selon plusieurs approches :une étude biologique, par comparaison de souches appartenant aux deux groupes afin d'obtenir le stade ascogène du champignon, nous a permis de montrer que ces deux groupes n'ont pas perdu leur potentialité à produire des cléistothèces in vitro, mais présentes des différences dans leur capacité à se croiser entre elles, la recherche de marqueurs moléculaires, distinguant les signes sexuels des souches d'U. necator, nous a conduit à émettre l'hypothèse selon laquelle l'organisation génétique du cluster, lié à la reproduction sexuée, serait plus proche du modèle rencontré chez les levures que celui existant chez les autres ascomycètes.Nous avons isolé et caractérisé une séquence de 280 paires de bases, codant pour une protéine dont le domaine est un domaine H.M.G. box. Nous avons développé un couple d'amorce spécifique du signe sexuel " positif ", cependant leur utilisation a conduit à l'amplification d'un fragment quelque soit le signe sexuel des souches utilisées. Cette observation nous oriente vers le rapprochement d'Uncinula necator avec Saccharomyces cerevisiaea. Un fragment de 640 paires de bases, révélé par l'utilisation croisée d'amorces dégénérées, nous a permis de définir un couple d'amorces spécifiques permettant de mettre en évidence la présence de souches de groupe A au vignoble. Le fragment cloné présente une forte homologie avec un rétro transposon de Colletotrichum glooesporioides. Nous pouvons nous poser la question de l'impact de la présence de rétro transposons dans la diversité génétique et biologique dans ce complexe des deux groupes d'Uncinula necator. ;Ainsi la détermination du groupe des souches, grâce à ce nouveau marqueur moléculaire, utilisable aussi bien sur des échantillons mono-conidiens purifiés au laboratoire que sur ceux récoltés au champs, nous ouvre également la perspective de l'utilisation de cette technique afin d'étudier la dynamique des populations d'Uncinula necator au vignoble.

Poster N° 4

Développement d'un microréseau d'ADN ribosomique afin de génotyper les espèces fongiques d'écosystèmes forestiers tempérés

M. Buée(1), P.-E. Courty(1), J. Garbaye(1), J.-P. Maurice(2), F. Le Tacon(1) & F. Martin(1)
(1) UMR INRA/UHP 1136 Interactions Arbres/Micro-organismes, INRA-Nancy, 54280 Champenoux
(2) Groupe Mycologique Vosgien, 18 bis, place des Cordeliers, 88300 Neufchâteau

Dans les écosystèmes forestiers tempérés, plusieurs dizaines d'espèces fongiques sont couramment associées à un même arbre et une centaine d'espèces est observée à l'échelle d'un peuplement. La description des communautés fongiques repose désormais sur l'inventaire des carpophores, la description morphologique des mycorhizes et le génotypage de ces tissus. Afin d'étudier la diversité du cortège ectomycorhizien de la chênaie-charmaie en Lorraine, nous avons inventorié les espèces ectomycorhiziennes présentes par amplification PCR et séquençage de l'espaceur intergénique (ITS) de l'ADN ribosomal nucléaire (cf. Pouységur et al.). L'ITS-2 présente un polymorphisme interspécifique élevé permettant le typage à l'échelle de l'espèce de la majorité des Ascomycètes et Basidiomycètes échantillonnés. Afin de faciliter le génotypage à l'échelle des communautés, nous développons un microréseau (biopuce) portant les régions polymorphes de l'ITS-2 d'une centaine d'espèces fongiques identifiées dans les forêts du Morvan et de Lorraine. Les filtres de Nylon sont hybridés aux [33P]ITS-2 amplifiés à partir d'échantillons d'ADN de carpophores, de racines mycorhizées ou de sol, issus des sites étudiés. La spécificité, la sensibilité et la reproductibilité des identifications réalisées à l'aide de cette biopuce seront discutées en les comparant au morphotypage et aux autres approches moléculaires (séquençage des apex ectomycorhiziens). Les analyses basées sur les biopuces taxinomiques faciliteront l'étude de la diversité spatio-temporelle des cortèges fongiques, un pré-requis pour les recherches en écologie fonctionnelle des champignons.

Poster N° 5

Différence de valeur sélective chez des isolats de rouille jaune du blé différant pour une virulence

B. Bahri, M. Leconte, C. de Vallavieille-Pope, J. Enjalbert
INRA-INAPG, Epidémiologie Végétale et Ecologie des Populations, 78850 Thiverval-Grignon

Si les gènes de résistance spécifique confèrent des résistances souvent totales contre de nombreuses maladies, leur efficacité est souvent éphémère du fait d'un rapide contournement par le parasite. Cependant, quelques cas de résistance spécifique durable ont été étudiés, et conduisent à relier leur durabilité à la fonction de l'avirulence qu'ils reconnaissent : plus cette fonction est importante pour la valeur sélective du parasite, et plus la virulence serait coûteuse (et la résistance durable) [1]. Afin de tester cette hypothèse, nous nous sommes attachés à mesurer la perte de valeur sélective imposée par l'acquisition de la virulence vr9 chez la rouille jaune du blé tendre, causée par Puccinia striiformis f.sp. tritici. Cette virulence est apparue en France en 1989 dans un pathotype possédant également la virulence vr6, mais ce pathotype n'a pas envahi la population française, malgré la présence de la double pression de sélection. Pour mesurer le coût associé à l'acquisition de la virulence vr9, une compétition a été réalisée entre le nouveau pathotype et le pathotype dont il est issu par mutation. Ces deux pathotypes ne diffèrent que par l'avirulence Avr9, et deux isolats naturels par pathotype ont été sélectionnés pour leur grande proximité génétique (même profil AFLP). Deux couples virulent/avirulent ont été constitués par un mélange 50/50 de spores, et ont été cultivés pendant 5 générations sur 2 variétés sensibles (sans le gène de résistance Yr9). Les fréquences de virulence ont été estimées à chaque génération, pour chaque couple, sur chaque variété, et ce pour deux répétitions. Les résultats ont montré pour un couple d'isolats une diminution de la valeur sélective de 20 % associée à la virulence. Par contre, pour l'autre couple d'isolats, il n'y a pas d'évolution significative, voire une très légère augmentation de la fréquence des virulents sur l'une des variétés. Ces résultats ne nous permettent donc pas de conclure sur l'existence d'un éventuel coût de virulence, et demandent des expérimentations complémentaires pour déterminer si il y a un coût et donc présence de mutations compensatoires, ou si il s'agit de variations d'agressivité indépendantes du gène de virulence.
[1]- Leach J., Vera Cruz C., Bai J. and Leung H. 2001. Pathogen fitness penalty as a predictor of durability of disease resistance genes. Annual Review of Phytopathology. 39, 187-224

Poster N° 6

Diversité génétique des populations de Colletotrichum gloeosporioïdes, agent causal de l'anthracnose sur igname en Guadeloupe

L. Frezal(1,2), G. Jacqua(2) et C. Neema(1)
(1)Laboratoire de Pathologie Végétale INRA, INA-PG, 16, rue Claude Bernard 75231 Paris- cedex 05
(2)Laboratoire de Pathologie Végétale INRA, URPV, Domaine de Duclos, 97170 Prise d'eau. Guadeloupe

L'igname est la troisième culture vivrière de Guadeloupe et l'espèce Dioscorea alata occupe 70% des surfaces cultivées d'igname. Colletotrichum gloeosporioïdes est un ascomycète, haploïde, polyphage avec un cycle asexué et un cycle sexué. Il est responsable de l'anthracnose de l'igname qui peut occasionner plus de 80% de pertes de production. En Guadeloupe certaines variétés ont, en 20 ans, perdu leur caractère résistant Par ailleurs, la résistance d'une même variété d'igname peut différer d'une île à l'autre de l'arc antillais. Les échanges actuels de tubercules entre les différentes îles des petites Antilles augmentent le risque d'introduction de souches indigènes virulentes sur les variétés d'igname en Guadeloupe, ce qui potentiellement peut accélérer l'érosion des résistances. La connaissance de la structure spatiale des populations pathogènes est donc nécessaire pour estimer ce risque et proposer des stratégies efficaces de gestion des résistances à l'anthracnose.
Une première étude de la diversité génétique de C. gloeosporioides pour des marqueurs AFLP, a montré l'existence d'une importante diversité des souches au sein des populations pathogènes en Guadeloupe (Degueret, 2001). Nous avons alors entrepris une étude de la diversité génétique pour des marqueurs moléculaires neutres et pour la virulence à l'échelle parcellaire pour 3 cultivars (Tahiti, Kabusah et Pacala) présentant un degré différent de sensibilité à l'anthracnose. Une différenciation entre toutes les parcelles a été mise en évidence pour les marqueurs moléculaires, avec des indices de différenciation (Fst) similaires. Il est donc difficile de distinguer les influences respectives de la pression exercée par l'hôte et de la dérive génétique. Par ailleurs, la forte différenciation observée entre les parcelles suggère une faible migration du champignon entre les parcelles au cours d'une saison de culture. Les tests de pouvoir pathogène montrent que toutes les souches testées sont virulentes sur les cultivars Plimbite, Pacala et Kabusah, cela quel que soit leur cultivar d'origine. Par contre, sur la variété Tahiti seules les souches isolées à partir de cette variété sont virulentes. Ces différents résultats suggèrent un rôle important de la composition de l'inoculum primaire dans le développement de l'épidémie. L'étude de la structuration des populations pathogènes à l'échelle des îles de la Caraïbe a été entreprise, elle permettra d'estimer l'influence de la migration du champignon via les tubercules.

Poster N° 7

Endosymbiose bactérienne chez le champignon ectomycorhizien Laccaria bicolor S238N : diversité et écologie des bactéries intracellulaires

J. Bertaux(1), M. Schmid(2), A. Hartmann(2), J. Garbaye(1), Pascale Frey-Klett(1)
(1) UMR INRA-UHP 1136 "Interactions Arbres/Micro-organismes", Centre INRA de Nancy, 54280 Champenoux, France
(2) GSF-National Research Center for Environment and Health, Institute of Soil Ecology, Ingolstädter Landstr. 1, D-85764 Neuherberg/München, Germany

Nombreux sont les exemples de champignons symbiotes, saprophytes ou pathogènes connus pour être difficiles à maintenir en collection de manière " pure ", sans contaminant bactérien (Dewey et al., 1999). Ces observations suggèrent l'existence de bactéries étroitement associées au mycélium fongique, de manière extracellulaire voire intracellulaire. Pourtant bien que très répandue dans le monde animal et végétal, l'endosymbiose bactérienne reste méconnue dans le cas des champignons, à l'exception des Glomeromycota.
Grâce à l'hybridation de sondes fluorescentes ciblant l'ARN ribosomal 16S bactérien (FISH) couplée à de la microscopie confocale à balayage laser, nous avons recherché la présence de bactéries intracellulaires dans le champignon ectomycorhizien Laccaria bicolor S238N, utilisé commercialement en France dans le cadre de la mycorhization contrôlée du Douglas.
Des bactéries intracellulaires ont été mises en évidence dans des cultures " pures " de L. bicolor S238N conservées au laboratoire (Bertaux et al., 2003). Différents groupes bactériens ont été identifiés : ? et ?-protéobactéries, Gram positives à faible pourcentage en GC. Cette diversité taxonomique dépend du milieu culture utilisé pour la conservation du mycélium. Dans des échantillons de mycélium associé à des racines en condition naturelle, en revanche, seules des ? et ?-protéobactéries ont été détectées.
Les bactéries colonisent à la fois des hyphes vivants et morts. Elles sont réparties de manière très hétérogène en foyers, dans lesquels elles colonisent plusieurs cellules contiguës. Cette distribution met en évidence une transmission verticale des bactéries de cellule à cellule. Mais une transmission horizontale, via l'environnement, n'est pas non plus exclue. Des expériences sont en cours pour tenter de vérifier cette hypothèse. L'influence de ces bactéries sur la symbiose ectomycorhizienne ainsi que sur la physiologie du champignon reste pour le moment indéterminée.
Références :
Bertaux J., Schmid M., Chemidlin Prevost-Boure N., Churin J.L., Hartmann A., Garbaye J., Frey-Klett P. 2003. In situ identification of intracellular bacteria related to Paenibacillus spp. in the mycelium of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N. Applied and Environmental Microbiology 69 : 4243-4248.
Dewey F.M., Wong Y.L., Seery R. Hollins T.W., Gurr S.J. 1999. Bacteria associated with Stagonospora (Septoria) nodorum increase pathogenicity of the fungus. New Phytologist. 144 : 489-497.

Poster N° 8

Développement de marqueurs moléculaires pour étudier la variabilité et la génétique des populations de Plasmopara viticola, agent du mildiou de la vigne

C. Greif(1), W.J. Chen(2), F. Delmotte(2), S. Decroocq(3), P. Coste(1), S. Wiedemann-Merdinoglu(1), D. Merdinoglu(1)
(1) INRA, UMR 1131 Vigne et Vins d'Alsace INRA-ULP Strasbourg, BP 507 68021 Colmar cedex
(2) UMR 1065 Santé Végétale INRA-ENITAB, BP 81 33883 Villenave d'Ornon cedex
(3) UREFV, BP 81 33883 Villenave d'Ornon cedex

L'exploitation dans des programmes de création variétale des gènes de résistance de la vigne au mildiou en cours de caractérisation ne peut se concevoir sans étudier en parallèle le potentiel d'adaptation du pathogène. Toute avancée dans la compréhension de la dynamique des populations de P. viticola face aux contraintes biotiques et abiotiques de l'environnement viticole aura un impact direct sur la gestion durable des résistances de la vigne. La validation de marqueurs microsatellites comme outils de suivi de la diversité génétique des populations de P. viticola en est le point de départ dans nos équipes. Récemment, des résultats préliminaires de génétique des populations obtenus à l'aide de 3 marqueurs microsatellites développés à l'ETH de Zürich ont montré qu'il existait une très grande variabilité génotypique dans le vignoble, qu'un génotype ne semblait se disperser qu'à proximité immédiate du symptôme d'origine (i.e. ceps adjacents) et que des inoculums possédant une grande variabilité génétique seraient à l'origine du développement épidémique, ce qui va à l'encontre du postulat généralement admis.
Il s'agit dans un premier temps d'augmenter le nombre de marqueurs microsatellites disponibles. Une banque d'ADN génomique de P. viticola enrichie en motifs microsatellites a été produite au laboratoire. Une douzaine de séquences non redondantes contenant des motifs microsatellites (di- et trinucléotidiques) ont été identifiées et sont en cours d'analyse pour désigner des amorces spécifiques. Le polymorphisme détectable par ces amorces sera déterminé par l'analyse d'isolats de mildiou issus d'implantations géographiques diverses, mais aussi de taches d'huile sur feuilles d'espèces de Vitis de niveaux de résistance variés.
Une fois validés ces marqueurs neutres permettront l'analyse de la structuration des populations de mildiou face à diverses contraintes environnementales, principalement les traitements fongicides et la résistance de l'hôte, mais aussi d'approfondir certains points clé de l'épidémiologie de la maladie en support aux modèles de prévision des risques.
L'incidence de différentes sources de résistance de Vitis sp. sur le développement du pathogène fait aussi partie de nos préoccupations pour conduire le choix des schémas de pyramidage des facteurs de résistance dans de nouvelles variétés escomptées durablement résistantes. Nous avons démarré l'étude de l'évolution de micro-populations de mildiou sélectionnées artificiellement par repiquage successif sur une gamme d'espèces américaines/asiatiques de Vitis de niveau de résistance connu (6 à 8 espèces dont V. riparia, V. rupestris, V. amurensis). Par observation du pouvoir pathogène (variation d'agressivité ?) et de la structure génétique (polymorphisme des séquences microsatellites) du pathogène au fur et à mesure des repiquages nous cherchons à évaluer l'effet de filtre opéré par chaque source de résistance sur une micropopulation donnée et comment un gain d'agressivité observé chez une espèce de Vitis se reporte sur d'autres sources de résistance.

Poster N° 9

Isolement de 20 loci microsatellites polymorphes chez le champignon ascomycète Venturia inaequalis, agent de la tavelure du pommier

F. Guérin(1), P. Franck(2), A. Loiseau(3), M. Devaux(1) et B. Le Cam(1)
(1) UMR PaVé INRA-INH-Université d'Angers, B.P. 57, 42 rue Georges Morel, F49071 Beaucouzé CEDEX, France.
(2) UMR 406 INRA-UAPV, Domaine de Saint-Paul, Site Agroparc, F85914, Avignon CEDEX 9, France.
(3) Centre de Biologie et de Gestion des Populations, Campus International de Baillarguet CS 30 016, F34988, Monferrier-sur-Lez CEDEX, France.

Les séquences microsatellites sont des marqueurs moléculaires polymorphes souvent utilisés dans l'étude de structures de populations, de parentés, de modes de reproduction, de flux de gènes… Jusqu'à présent sept marqueurs microsatellites ont été développés pour V. inaequalis (Anamorphe Spilocaea), le champignon responsable de la tavelure du pommier. Cependant seulement trois de ces marqueurs présentent un niveau de polymorphisme suffisamment élevé pour être utilisables dans des études de génétique des populations. C'est pourquoi nous avons développé et caractérisé 20 nouveaux loci microsatellites suite à l'obtention d'une banque d'ADN de V. inaequalis enrichie à l'aide des motifs de répétition TC et TG. Le polymorphisme de ces loci a été évalué par leurs amplifications sur 44 ADN de souches de V. inaequalis. Nous avons détecté un niveau de polymorphisme variable (2 à 24 allèles par locus) avec un polymorphisme moyen de 9.15 allèles par locus. Ces 20 marqueurs ont aussi été testés sur des souches d'espèces proches de V. inaequalis : Spilocaea pyracanthae, Spilocaea eriobotryae, Venturia pirina et Venturia nashicola. Les résultats ont montré que la plupart des nouveaux marqueurs microsatellites étaient également utilisables sur S. pyracanthae et S. eriobotryae.

Poster N° 10

Caractérisation des Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum responsables de la fusariose du cotonnier en Côte d'Ivoire

K. Abo, K. Klein, V. Edel-Herrmenn, et C. Steinberg
INRA UMR MGS, 17 rue Sully, BP 86510, 21065 DIJON cedex

Dix-sept isolats de Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum de Côte d'Ivoire ont été caractérisés sur la base de leur assignation à des groupes de compatibilité végétative (VCG), de l'analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction de l'espace inter-génique du rDNA (IGS) et mating type idiomorph (MAT). Cette caractérisation a été comparée à celle réalisée sur une collection comprenant toutes les souches pathogènes de référence actuellement disponibles au niveau international. Quelques isolats de Côte d'Ivoire sont identiques aux souches de référence déjà connues pour tous les caractères examinés. Par contre, au moins un nouveau VCG et plusieurs types IGS non encore décrits ont été révélés. Les deux mating types ont été trouvés dans chacune des deux collections (Ivoirienne et internationale). La combinaison des différents critères de caractérisation a permis de constituer des groupes de souches possédant les mêmes caractères. Les souches Ivoiriennes se distribuent dans presque tous les groupes suggérant des sources possibles impliquées dans l'expansion actuelle de la maladie en Côte d'Ivoire. Malgré la présence des deux mating-types, il n'y aucune trace de recombinaison. Globalement, la variabilité génétique au sein de la forma specialis vasinfectum est très grande, mais significativement moins que celle observée par ailleurs dans les populations de F. oxysporum non pathogènes.

Poster N° 11

Informatisation de la gestion d'une base de données d'individus biologiques

M. Mary, F. Guérin et B. Le Cam
UMR Pavé INRA, INH, Université d'Angers. Centre INRA- 42, rue Georges Morel - BP 57 - 49071 Beaucouzé

Les études développées au laboratoire sur Venturia spp. nécessite l'analyse de plusieurs centaines d'échantillons (souches et/ou ADN). Face à l'apport important d'informations obtenues (SSR, AFLP, séquences…), nous avons développé une application permettant (1) d'informatiser la collection, (2) de faciliter le traitement des données. Les outils Apache, PHP 4 et MySQL ont été utilisés. L'application fonctionnelle assure la centralisation des informations mises en réseau et permet un gain de temps dans la génération de matrices dont les formats de sortie sont adaptés aux principaux logiciels d'analyse de génétique des populations (Arlequin, Génétix, Genepop …). L'obtention de matrices se réalise grâce à un moteur de recherche permettant d'extraire de la collection des populations selon des critères préalablement renseignés dans l'application (origine géographique, cultivar d'origine, taille allélique à un locus SSR donné…). Cette interactivité permet de tester rapidement et de manière aisée des hypothèses sur les caractéristiques des populations étudiées (différenciation en fonction de l'hôte, du pays, influence du mode de reproduction sur la structure de la population...). Son système de double authentification permet à présent son utilisation par d'autres groupes de travail du Centre INRA d'Angers et son organisation en classes permettra d'incorporer facilement de nouveaux modules.

Poster N° 12

Diverse roles of endophytic fungi in reeds and the use of Stagonospora spec. in seeds for establishment of new reed stands

K. Mendgen, M. Ernst, K. Neubert, and S.G.R. Wirsel
Lehrstuhl Phytopathologie, Fachbereich Biologie, Universität Konstanz, Universitätsstr. 10, D-78457 Konstanz, Germany

We have started to elucidate the role of endophytic fungi in reed. Fungi isolated from surface sterilized tissue of Phragmites australis were identified and characterized by morphological and molecular methods from dry and flooded sites at Lake Constance (Germany).
With a set of universal PCR primers, we amplified DNA from a wide range of fungi. DNA was extracted from all vegetative organs and used for amplification and cloning of the fungal ITS rDNA region. RFLP analysis of the cloned fragments revealed over 400 different restriction patterns. The most frequently occurring RFLP types were sequenced yielding approx. 75. different operational taxonomic units. More than half of these were not represented in public gene databases. However, only a limited number of different fungi dominated each organ.
Especially seeds are regularly colonized by isolates from the genus Stagonospora.
A time course study using nested PCR assays revealed that in spring, Stagonospora is detected in roots only whereas in autumn, it could be frequently found in all organs, including seeds. Microcosm experiments demonstrated that seeds harbor viable propagules of the fungus that colonized the developing germling indicating vertical transmission. In microcosm experiments with flooded soils several isolates of Stagonospora enhanced reed biomass considerably. On dry sites, however, roots were found to be associated with arbuscular mycorrhizal fungi. After PCR assays targeting the 18S rDNA, and subsequent cloning, RFLP, sequence and phylogenetic analyses, we distinguished 21 phylotypes of mycorrhizal fungi.

Poster N° 13

Molecular phylogeny of the Leptosphaeria maculans-L. biglobosa species complex

E. Mendes-Pereira(1), M.-H. Balesdent(1) H. Brun(2), T. Rouxel(1)
(1) INRA, PMDV, Route de Saint Cyr, 78026 Versailles
(2) UMR Bio3P, INRA, Domaine de la Motte, BP 35327, 35653 Le Rheu

Numerous species of Leptosphaeria were historically described to develop on Crucifers, either as saprophytes or pathogens, the latter responsible for the "stem canker" (or Blackleg) disease of crucifers. With time, and because Leptosphaeria species comprise a group of morphologically very simple fungi, most of these species were considered a single species, L. maculans (anamorph, Phoma lingam). This single species, however, showed unexplained polymorphism, whichever biological, biochemical or molecular tool was used. Principally, in vitro mating studies suggested the presence of at least four genetically isolated entities within the former L. maculans species, of which two species, L. maculans and L. biglobosa, were unequivocally separated on the basis of morphological differences of pseudothecia. In the present study, sequences of the entire ITS region, including the 5.8s rDNA, of 38 isolates representing seven subgroups (separated according to host plant, biological, biochemical or molecular criteria), along with specimens from culture collections, were analysed, compared to those of closely related Leptosphaeria species, and the phylogeny inferred using parsimony and distance analyses. A well-supported clade encompassed all L. maculans isolates along with L. conferta, a known saprobe of dried crucifer stems. The L. maculans isolates were further separated into two well-supported clades corresponding to L. maculans sensu stricto and the recently named L. biglobosa. Parsimony and distance analyses further separated groups within both species, usually corresponding to specific host plants or geographic origin, e.g. L. maculans 'brassicae' from cultivated Brassica, L. maculans 'lepidii', from Lepidium sp., L. biglobosa 'brassicae', from various Brassica species, L. biglobosa 'thlaspii' from Thlaspi arvense, L. biglobosa 'erysimii' from Erysimum sp., and L. biglobosa 'canadensis' mostly found in central Canada. The oldest L. maculans specimens maintained in international collections clustered with either L. maculans 'brassicae', L. biglobosa 'brassicae', or a still different group closely related to L. biglobosa 'thlaspii'. The evolutionary relationships between the seven infraspecific groups are discussed in terms of phytopathological relevance and species isolation linked with specific life cycle, geographic isolation or host specificity.

Poster N° 14

Altération du niveau de résistance de 2 sols aux maladies dues à Rhizoctonia solani et à Fusarium oxysporum par des amendements organiques

C. Steinberg, V. Edel, C. Guillemaut, A. Perez Piqueres, P. Singh, C. Alabouvette
INRA-CMSE, UMR MGS 17 rue Sully, BP 86510, 21065 Dijon

En dépit de la présence d'un inoculum microbien pathogène dans le sol, parfois même à de fortes densités d'inoculum, l'expression de l'activité infectieuse du pathogène est limitée par les interactions biotiques-abiotiques, ce qui conduit à une faible manifestation de la maladie. On parle alors de sol résistant à cette maladie. Ce niveau de résistance peut être modifié par des pratiques agricoles telles que les amendements organiques. Du composts et du fumier ont été apportés dans 2 sols. L'un sablo-limoneux est résistant aux maladies dues à R. solani et plus sensible à la fusariose, l'autre, argilo-limoneux est résistant aux maladies dues à F. oxysporum mais sensible à celles dues à R. solani.
La biomasse microbienne des sols a augmenté suite aux amendements mais l'impact le plus significatif est celui observé sur les profils d'activité des communautés bactériennes (Biolog) et ses conséquences sur la résistance des sols aux maladies :
Le sol limono-argileux présente naturellement une très forte activité métabolique qui ne peut être augmentée par l'apport de fumier ou compost. De même, sa résistance naturelle aux fusariose n'est pas modifiée, par contre ce sol devient résistant aux maladies dues à R. solani.
A l'inverse, le sol sablo-limoneux, dont l'activité métabolique naturelle très faible augmente suite aux amendements, devient résistant aux fusarioses, mais sa résistance naturelle aux maladies dues à R. solani n'est pas modifiée.
Enfin, la diversité des activités métaboliques bactériennes des sols n'est pas affectée par les apports de fumier et composts, par contre l'analyse par T-RFLP de l'ADNr révèle que dans chacun des sols, la structure des communautés fongiques est modifiée suite aux amendements. Les composantes de la communautés fongiques de chaque sol affectée par les amendements organiques n'ont pas encore été identifiées mais elles pourraient inclure des populations introduites ou stimulée par la matière organique et dont le développement participerait à la limitation de l'activité infectieuse de R. solani.
Par des mécanismes différents, les apports de matières organiques ont une action positive sur la résistance des sols quand ils sont sensibles à une maladie et neutre quand ils sont résistants. Les mécanismes impliqués dans la limitation de l'expression de l'activité infectieuse du pathogène ne sont pas les mêmes selon les exigences écologiques des pathogènes concernés, et sont modulés par les propriétés de l'environnement édaphique.