Résumés des posters - Thème : Interactions Plantes-Champignons






Poster N° 1

Phosphate metabolism in arbuscular mycorrhizal fungi: a molecular approach

Benedetto A., Lanfranco L., Bonfante P.
Dipartimento Biologia Vegetale, Viale Mattioli 25, 10125 Torino, Italy

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi form symbiotic associations with most land plants and promote the growth of the host through enhanced uptake of phosphorus. Once the association is established, the fungi take up inorganic phosphate (Pi) from the soil through extraradical hyphae, accumulate Pi into vacuoles as polyphosphates (polyP) and translocate polyP to intraradical hyphae. This is assumed to be followed by hydrolysis of polyP and subsequent release of Pi into the plant-fungus interfacial apoplast (Ezawa et al., 2001). The molecular basis of these processes are not completely known as, up to now, just two Pi transporter genes has been isolated from AM fungi (M. Harrison & van Buuren, 1995; I.E. Maldonado Mendoza et al., 2001).
In this work we used different approaches to identify genes involved in P metabolism in AM fungi. Degenerate primers were designed on conserved amino acid domains of Pi transporter and used in PCR experiments to amplify genomic DNA from AM spores. A fragment of 846 bp showing high similarity with Pi transporters was identified from the fungus Glomus mosseae (BEG12). Then the fragment was extended to 1186 bp using RACE experiments on G.mosseae external mycelium cDNA. In parallel experiments, a screening of a genomic library from Gigaspora margarita (BEG34) with a heterologous probe led to the isolation of a positive plaque which is currently under analysis. In addition, a clone showing high similarity with polyphosphate synthases was identified from an EST collection from germinated spores of Gigaspora margarita (BEG34). Taken in their whole, the results demosntrate that a number of PT transporter genes are present in AM fungi belonging to different taxa (Schubler et al., 2001) and some of them are surely expressed in presymbiotic and/or extraradical fungal structures.
Acknowledgments: Research funded by the EU project GENOMYCA, Contract No.:QLK5-CT- 2000-01319
References:
Ezawa T., Smith S.E., Smith F.A. (2001). New Phytol. 149:555-563.
Harrison M.J., Van Buuren M.L. (1995). Nature 378:626-629.
Maldonado-Mendoza I.E., Dewbre G.I., Harrison M.J. (2001). Mol. Plant-Microbe Interact. 10:1140-1148.
Schubler A., Schwarzott D., Walker C. (2001). Mycol. Res. 105 (12):1413-1421.

Poster N° 2

Transformation du champignon ectomycorhizien Hebeloma cylindrosporum par Agrobacterium tumefaciens

Jean-Philippe Combier, Delphine Melayah, Roland Marmeisse et Gilles Gay
Université Claude Bernard Lyon 1 - UMR 5557 d'écologie microbienne
43 Bd du 11 Novembre, 69622 Villeurbanne cedex

Bien qu'Agrobacterium tumefaciens ne soit pas pathogène des champignons, il peut transférer l'ADN-T de son plasmide Ti à des cellules fongiques qui l'intègrent dans leur ADN génomique. Cette propriété est à l'origine du récent développement d'une méthode de transformation des espèces fongiques qui présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes traditionnelles utilisant des plasmides circulaires ou linéaires. D'une part, elle ne nécessite pas la préparation de protoplastes et d'autre part le mode d'intégration de l'ADN-T dans l'ADN génomique permet de caractériser facilement les séquences génomiques flanquantes. Peu de Basidiomycètes ont pour l'instant été transformés en utilisant cette bactérie. Nous décrivons ici une méthode de transformation génétique d'Hebeloma cylindrosporum, Basidiomycète ectomycorhizien, par A. tumefaciens. Une analyse par PCR et Southern blot a montré que tous les transformants obtenus (treize pour l'instant) ne possèdent qu'une seule copie de l'ADN-T intégrée. Une analyse par TAIL PCR nous a permis d'identifier les sites d'intégration de ces insertions. Cette méthode est actuellement utilisée au laboratoire pour obtenir des mutants non mycorhiziens d'H. cylindrosporum. Les résultats présentés ici montrent que l'identification des gènes inactivés est plus facile que dans le cas de la mutagenèse par insertion de plasmide.

Poster N° 3

Identification de signaux rhizosphériques échangés entre champignons et racines d'arbres forestiers, formant la symbiose ectomycorhizienne : Activité anti-auxinique des alcaloïdes indoliques, identification des mécanismes.

Anne Jambois (1), Franck A Ditengou (1), Tomonori Kawano (1), Alain Delbarre (2), Frédéric Lapeyrie (1)
(1) INRA UMR Interactions arbres / Micro-organismes 54280 Champenoux France
(2) CNRS 91198 Gif sur Yvette Cedex, France

L'établissement d'une symbiose mycorhizienne nécessite la mise en place d'un dialogue moléculaire spécifique entre le partenaire fongique et le partenaire végétal. Chez le couple Eucalyptus globulus - Pisolithus tinctorius, certaines étapes de l'ontogenèse mycorhizienne nécessiteraient un subtil équilibre entre des molécules actives telles que l'AIA et des molécules régulatrices telles que l'hypaphorine, un alcaloïde indolique synthétisé et accumulé en grandes quantités dans les hyphes au contact de la racine. À ce jour, l'hypaphorine n'a été détectée que dans les hyphes de P. tinctorius.
Il a été suggéré que chez les champignons ectomycorhiziens ne produisant pas d'hypaphorine, d'autres alcaloïdes indoliques pourraient jouer le rôle de régulateur de l'activité auxinique. Pour répondre à cette hypothèse, nous avons testé l'activité anti-auxinique de 2 alcaloïdes indoliques du commerce : la brucine et la yohimbine.
Les 2 alcaloïdes du commerce inhibent, tout comme l'hypaphorine, l'activité de l'AIA sur l'élongation du pivot, des poils absorbants, et de l'hypocotyle, sans altérer le transport de l'hormone à l'apex des racines ou dans des cellules en culture.
L'interaction entre l'AIA et les 3 alcaloïdes testés serait de type compétitive et spécifique : ces molécules interagissant avec l'AIA, mais pas avec l'ANA ou le 2,4-D, deux auxines de synthèse, non indoliques.
Ces résultats suggèrent que l'hypaphorine, la brucine, et la yohimbine entreraient en compétition avec l'AIA au niveau d'un récepteur auxinique (par exemple sur une ABP (Auxin-Binding Protein)), et que, dans certains cas, le 2,4-D et l'ANA ne seraient pas perçus par le même récepteur.
Sachant que la plupart des 1200 alcaloïdes indoliques connus à ce jour, ont été identifiés chez les plantes supérieures, ceci suggère que les alcaloïdes indoliques endogènes pourraient être impliqués dans la régulation de l'activité de l'AIA au cours de certaines étapes du développement d'une plante et dans des tissus ou des cellules spécifiques. L'hypaphorine, ainsi que d'autres alcaloïdes indoliques, qui restent à identifier, apparaissent donc comme une nouvelle classe d'antagonistes de l'AIA pouvant réguler son activité aux côtés d'autres mécanismes connus, comme la conjugaison ou la dégradation.

Poster N° 4

Cell wall degrading enzymes in the root-knot nematode Meloidogyne incognita

Stéphanie Jaubert, Jean Baptiste Laffaire, Pierre Abad et Marie Noëlle Rosso.
INRA Antibes, Unité Interaction Plante-Microorganismes et Santé Végétale, 123 bld Francis Meilland BP 2078, 06606 Antibes rosso@antibes.inra.fr

Les nématodes à galle du genre Meloidogyne sont des phytoparasites biotrophes dont le parasitisme se compose d'une phase mobile et d'une phase sédentaire. Lors de la phase mobile, la larve infestante pénètre dans une racine au niveau de la zone d'élongation et migre de façon intercellulaire le long du cylindre central. La larve se sédentarise ensuite dans la zone de différentiation et induit la formation d'une structure spécifique aux nématodes à galle : le site nourricier. Cette structure est constituée de cellules végétales multinucléées appelées cellules géantes qui résultent de la différentiation des cellules procambiales en réponse à des signaux émis par le nématode. Les sécrétions du stylet, synthétisées au niveau des glandes œsophagiennes du nématode et sécrétées dans les tissus racinaires au cours du parasitisme semblent jouer un rôle clef dans l'interaction plante-nématode. Ces sécrétions pourraient intervenir dans les étapes de pénétration et de migration intercellulaire, ainsi que dans la différentiation et le maintien du site nourricier. Afin d'identifier les protéines contenues dans ces sécrétions et de mieux comprendre les mécanismes moléculaires intervenant au cours de la relation parasitaire plusieurs stratégies d'étude ont été développées. L'une d'elles, la stratégie gène-candidat, a permis d'identifier par le passé deux enzymes cellulolytiques comme étant des composants des sécrétions du stylet du nématode à galle modèle Meloidogyne incognita. Cette stratégie, associée à l'analyse d'ESTs nous a permis d'identifier trois enzymes pectinolytiques synthétisées dans les glandes œsophagiennes des larves infestantes de M. incognita : une polygalacturonase et deux pectate lyases. Ces enzymes, intervenant dans le processus de dégradation des pectines, pourraient jouer un rôle lors des étapes de pénétration et de migration du nématode à travers la racine.

Poster N° 5

The development of simple sequence repeat (SSR) markers for Magnaporthe grisea and their integration into an established molecular linkage map

Claudia Kaye(1), Joëlle Milazzo(1), Suchada Mongkolsamrit(2) Pattama Sirithunya, (2)Marc-Henri Lebrun(3) and Didier Tharreau(1)
Cirad (1) Avenue Agropolis-TA 73/09, 34398 Montpellier Cedex 5, Rajamangala Institute of Technology (2) (RIT; Lampang Agricultural Research and Training Centre, Lampang) and National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC), Bangkok, CNRS-AVENTIS (3)Physiologie Cellulaire VégétaleUMR1932, 14-20 rue P. Baizet 69263 Lyon

Microsatellites or simple sequence repeats (SSR) can be used for genomic mapping, population studies and DNA fingerprinting. We have identified and characterized SSR containing sites in the filamentous ascomycete Magnaporthe grisea, the causal agent of rice blast disease, by constructing and screening an enriched library and by searching public databases. Both methods proved useful in uncovering microsatellites. A total of 40 SSRs (25 from the database screen and 15 from the enriched library) were screened for product length polymorphism on six Magnaporthe grisea isolates including GUY 11 and 2539, the parents of a cross from which a genetic map of the fungus has been developed. The number of alleles at each site ranged from one to six when assayed on 3% agarose gels. Inheritance and linkage was determined for twenty polymorphic sites in 60 F1 progeny from the above cross. Analysis of allele segregation showed that all the markers segregated in the expected 1:1 ratio. Map positions were determined for all 20 with at least one marker mapping to each of the seven known chromosomes. The SSR markers were stable and easy to assay. A preliminary population study using the developed SSR markers on isolates from Thailand proved to be useful in helping to group and classify these individuals.

Poster N° 6

Pls1p, une tétraspanine fongique impliquée dans le fonctionnement de l'appressorium du champignon Magnaporthe grisea

Mathieu Gourgues, Joaquim Cots, et Marc-henri Lebrun.
1Physiologie Cellulaire végétale, UMR1932 CNRS/Biotechnologies, Aventis CropScience, 14 rue Pierre Baizet, 69009 Lyon

PLS1 est un gène nécessaire à la pénétration du champignon pathogène Magnaporthe grisea dans les feuilles de riz. Le mutant PLS1- différencie des appressoria ayant une pression de turgescence normale, mais incapables de former l'hyphe de pénétration nécessaire pour percer la cuticule et la paroi de la cellule épidermique. Le gène PLS1 code pour une protéine membranaire de 225 acides aminés apparentée à la famille des tétraspanines. Ces protéines qui n'avaient été identifiées jusqu'à présent que chez les animaux, font partie de complexes protéiques membranaires impliqués dans des voies de signalisation contrôlant l'adhésion , la différenciation et le mouvement cellulaire. Ce type de signalisation pourrait aussi exister chez les champignons et contrôler la différentiation de l'hyphe de pénétration. Nous avons montré que la protéine Pls1p n'est exprimée que dans les appressoria différenciés sur des feuilles ou des membranes artificielles, avant et pendant la pénétration. L'expression différentielle de PLS1 est régulée au niveau post-transcriptionnel, puisque l'ARN messager de PLS1 est détecté dans tous les type de cellules fongiques. PLS1 possède de longs 5'UTR et 3'UTR qui pourraient contenir des séquences impliquées dans ce contrôle post-transcriptionnel. Une protéine fusion GFP-Pls1p fonctionnelle, puisque capable de complémenter le mutant PLS1-, a été utilisée pour déterminer la localisation de Pls1p dans les appressoria. Seule une petite quantité de la protéine fusion est présente dans la membrane plasmique appressoriale tandis que la majorité est détectée dans des vacuoles, ce qui suggère un recyclage rapide de Pls1p par endocytose. La modification de Pls1p par mutagenèse dirigée montre qu'un domaine cytoplasmique est essentiel à son fonctionnement. Ce domaine pourrait être impliqué dans des interactions entre Pls1p et des protéines cytoplasmiques appartenant à une voie de signalisation appressoriale contrôlant la pénétration.

Poster N° 7

Genes expressed during the saprotrophic and the symbiotic phases in the ectomycorrhizal fungus Tuber borchii Vittad

Laura Miozzi1, Raffaella Balestrini2 and Paola Bonfante1,2
1Dipartimento di Biologia Vegetale - Università di Torino e 2Centro di Studio sulla Micologia del Terreno del CNR, V.le Mattioli 25 - 10125 Torino, Italy

Truffles are ascomycetes which live in symbiotic association with the roots of gymnosperms and angiosperms. Like other ectomycorrhizal fungi, they display a three stage-life cycle: a mycelial independent stage, a symbiotic mycorrhizal stage and a reproductive one leading to ascoma formation. In this study we characterized two EST (Expressed Sequence Tag) clones (VA48 and VA51), randomly isolated from T. borchii mycelium cDNA libraries, in order to investigate whether they are involved in the transition from the saprotrophic to symbiotic stage. VA48 clone (full length, 1158 bp), that does not show any significant similarity with known sequences, has been found to encode for a small rich-cystein protein (12 cys-residues) with a putative secretion peptide signal. VA51 cDNA fragment (643 pb) shows similarity to a b-glucosidase gene (b-glucosidase 5, Coccidioides immitis), an enzyme that is implicated in cell wall catabolism and sugar metabolism.
The gene expression has been studied in the mycelium and in the mycorrhiza of T. borchii by using RT-PCR experiments with specific primers designed on cDNA sequences. Mycelia were grown at different nutrient conditions and an in vitro ectomycorrhizal system between Cistus incanus and T. borchii has been developed. Preliminary results indicate that the EST clones are expressed in T. borchii during both mycelial and ectomycorrhizal stages. Semi-quantitative RT-PCR experiments will confirm whether the genes are differentially expressed under starvation conditions or during the different stages of the fungal life cycle.

Poster N° 8

Environnement génomique du gène d'avirulence AvrLm1 chez Leptosphaeria maculans

Agnès Attard1, Marie-Line Kühn1, Laurence Cattolico2, Michel Meyer1, Marie-Hélène Balesdent1, Thierry Rouxel1
1 INRA, PMDV, Route de Saint Cyr, 78026 Versailles, France; 2 Génoscope-CNS, 2, rue Gaston Crémieux, 91006 Evry, France

Une carte génétique de Leptosphaeria maculans a été construite sur un croisement mettant en ségrégation le gène d'avirulence AvrLm1 [1]. Cette carte est à la base de la marche chromosomique actuellement en cours pour le clonage d'AvrLm1. Sept marqueurs étroitement lies à AvrLm1 ont ainsi été identifiés [2,3]. Parmi ceux-ci, trois marqueurs SCARs ne montrent aucun événement de recombinaison avec AvrLm1 dans 5 croisements sommant 312 descendants [2]. L'utilisation de tels marqueurs pour le criblage d'une banque BAC représentant 7 equivalents-génome nous a permis de sélectionner et d'organiser en contig cinq clones, couvrant 184010 pb de la région contenant potentiellement AvrLm1 [2]. Le séquençage intégral de la région montre que les marqueurs co-ségrégeants correspondent à une région d'environ 121 kb. La séquence montre par ailleurs la propriété d'être extrêmement riche en A+T (63%), à l'exception d'un îlot de 30-kb, équilibré en G+C et riche en ORFs putatives. La plupart des ces ORFs montrent d'ailleurs de fortes similarités avec des gènes identifiés chez les levures ou d'autres filamenteux. 73% de la séquence correspondent à de grands fragments de séquences montrant des homologies avec des éléments répétés divers, composites et/ou fortement dégénérés. Ainsi sont identifiés dans la séquence, (i) 5 variants de LMR1, un élément répété endogène de L. maculans, (ii) des séquences identiques à des rétrotransposons dégénérés ou non (Maggy, Grasshopper, etc.) dispersées le long du contig ou (iii) organisées en deux répétitions inversées de 25-kb. L'annotation de la séquence (et l'identification d'AvrLm1) est actuellement enrichie d'une approche de cDNA-AFLP entre souches quasi-isogéniques, visant à identifier des ORF non détectées par les logiciels de prédiction de séquences codantes.
[1] M.-H. Balesdent, A. Attard, M. Gourgues, M. L. Olivier-Kuhn, T. Rouxel (1999). Map-based cloning of avirulence genes in the phytopathogenic ascomycete Leptosphaeria maculans. I. Genetic linkage map and molecular markers linked to AvrLm1. 9th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, 25-30 juillet 1999, Amsterdam, Pays-Bas
[2] A. Attard, L. Gout, M. Gourgues, M-L. Kühn, J. Schmit, S. Laroche, D. Ansan-Melayah, A. Billault, L. Cattolico, M-H. Balesdent, T. Rouxel (2002). Analysis of molecular markers genetically linked to the Leptosphaeria maculans avirulence gene AvrLm1 in field populations indicate a highly conserved event leading to virulence on Rlm1 genotypes. MPMI (sous presse)
[3] A. Attard, M. Gourgues, L. Gout, J. Schmit, J. Roux, J. P. Narcy, M.-H. Balesdent, T. Rouxel (2001). Molecular characterisation and polymorphism of MinLm1, a minisatellite from the phytopathogenic ascomycete Leptosphaeria maculans. Current Genetics, 40, 54-64.

Poster N° 9

L' éliciteur CBEL est impliqué dans l'interaction de Phytophthora avec la cellulose

Martina RICKAUER, Elodie GAULIN, Alain JAUNEAU, François VILLALBA, Marie-Thérèse ESQUERRE-TUGAYE, Arnaud BOTTIN - UMR 5546 UPS-CNRS - 24 Chemin de Borderouge - 31326 Castanet - Tolosan

Phytophthora parasitica var. nicotianae, oomycète pathogène du Tabac, produit in vitro et in planta une glycoprotéine pariétale, appelée CBEL (1). Cette glycoprotéine est capable d'induire des réactions de défense chez les plantes et de se lier à la cellulose ainsi qu'à d'autres sucres via une activité lectine (2). Il a été proposé que CBEL pourrait avoir un rôle dans la structure de la paroi de Phytophthora ou/et dans l'adhésion du microorganisme à un substrat ou à la surface de la plante-hôte.
Afin d' étudier le rôle intrinseque de cette protéine, nous avons entrepris de modifier l'expression de CBEL par transformation génétique. Des souches transgéniques dans lesquelles la production de CBEL a été supprimée ont été obtenues, et leur phénotype in vitro a été étudié. Alors que la croissance sur milieu standard n'est pas affectée, l'adhésion à des surfaces cellulosiques est sévèrement réduite pour des souches n'exprimant pas CBEL. Des observations microscopiques révèlent des structures spécifiques au contact avec la cellulose, uniquement chez les souches produisant CBEL. L'analyse par microscopie éléctronique et marquage PATAg montre que la structure même de la paroi cellulaire de Phytophthora est modifiée en l'absence de CBEL.
1 - Séjalon Delmas et al. (1997) Phytopathology 87, 899-909.
2 - Villalba-Mateos et al. (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1045-1053.